一：液相色譜法概述

　　液相色譜法(HPLC)是上個世紀七十年代迅速發(fā)展起來的一項、快速的分析分離技術(shù),，是現(xiàn)代分離測試的重要手段,。色譜法的分離原理是：溶于流動相( phase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(station phase)發(fā)生作用(吸附,、分配,、排阻、親和)的大小,、強弱不同,，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出,。又稱為色層法,、層析法。

　　HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,，其以液體作為流動相,，并采用顆粒極細的固定相的柱色譜分離技術(shù)。其分離機制與常規(guī)柱色譜相同,，但填料更加精細,，需高壓泵推動，柱效高,，分析速度快,。與氣相色譜不同的是液相色譜中流動相亦參與組分的分離過程，其組成,、比例和pH值可靈活調(diào)節(jié),，分離模式多樣。在實際操作中主要通過改變流動相的組成來調(diào)節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性,，從而使不同樣品得到分離,。

　　液相色譜法自20世紀60年代問世以來，由于使用了高壓輸液泵,、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測器,，實現(xiàn)了對樣品的高速、和高靈敏度的分離測定,。液相色譜由于吸取了經(jīng)典液相色譜的研制經(jīng)驗,，并引入微處理機技術(shù),，極大的提高了儀器的自動化水平和分析精度。現(xiàn)在用微處理機控制的液相色譜儀,，其自動化程度很高,，既能控制儀器的操作參數(shù)(如溶劑梯度洗脫、流動相流量,、柱溫,、自動進樣、洗脫液收集,、檢測器功能等),，又能對獲得的色譜圖進行收縮、放大,、疊加,，以及對保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進行處理等,，為色譜分析工作者提供了率,、功能齊全的分析工具。

　　液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛,，對樣品的適用性廣,，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,，幾乎所有的化合物包括高沸點,、極性、離子型化合物和大分子物質(zhì)均可用液相色譜法分析測定,，因而彌補了氣相色譜法的不足,。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20% ,，而80% 則需用液相色譜來分析,。HPLC因其具有分離效能高、分析速度快,、檢測靈敏度好,、能分析和分離高沸點且不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質(zhì)的特點而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物及臨床分析,，世界各國己將該法收載于藥典,。

　　火焰離子化檢測器、手性,、化學(xué)發(fā)光,、核磁共振、質(zhì)譜檢測器等新型檢測技術(shù)

　　由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點限制,，因此具有更廣闊的應(yīng)用潛力,。經(jīng)過30多年的迅速發(fā)展,，液相色譜法在基礎(chǔ)理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已趨于成熟,，現(xiàn)已成為化學(xué)化工,、環(huán)境、藥學(xué),、食品等多個領(lǐng)域中具優(yōu)勢的分離分析方法之一,。

　　二：基本原理

　　液相色譜根據(jù)分離機理的不同可分為：

　　¬液固吸附色譜

　　¬液液分配色譜

　　¬離子交換色譜

　　¬離子對色譜法

　　¬分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)

　　(一)液-固吸附色譜

　　流動相為液體，固定相為固體吸附劑,，根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來分離物質(zhì),。

　　(二)液-液分配色譜

　　流動相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進行分離,。一種液相為流動相,，另一種是涂于載體上的固定相。

　　流動相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法,。

　　流動相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法,。

　　(三)離子交換色譜

　　(四)離子對色譜法

　　(五)分子排阻色譜法

　　三：常見故障和維護

　　3.1 HPLC對流動相的一般要求

　　流動相就比如人體的血液，其質(zhì)量直接影響到整個系統(tǒng)的正常運行與否,。

　　應(yīng)該使用HPLC級的溶劑,，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換!一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時，使用異丙醇作為過渡溶劑,。

　　注意溶劑的截止波長,。截止波長是指該溶劑可以在紫外檢測器中使用的低波長，低于該波長后,，溶劑會有很強的紫外吸收,，從而影響極限的穩(wěn)定性、干擾對所分析物質(zhì)的檢測,。

　　HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過0.45μm濾膜過濾過的,。建議每天更換新鮮的水。長期不用時,，必須把使用水的管路用有機溶劑置換,，防止長霉。

　　儀器使用完后要采用適當?shù)娜軇_洗等方法維護色譜柱和系統(tǒng),。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈,。

　　儀器長期不用時，不建議使用純乙腈封存,。因為乙腈有生成聚合物的趨勢,。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。

　　當有流路堵塞時,，可以嘗試將之反接后沖洗,。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵和系統(tǒng)的的性能,。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH 4 至7) 中尤其如此,。

　　3.1.1 過濾器

　　•檢查溶劑過濾器

　　查看過濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)–擰開脫氣機出口或比例閥入口管線，此時溶劑會因為重力流出,。當脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時,，溶劑會流出不暢或不流出–臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常,。

　　•清潔溶劑過濾器

　　將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下,，用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸(35%左右)的燒杯里浸一小時,。用二次蒸餾水*沖洗過濾器至水為中性可以把過濾器放在塑料燒杯內(nèi)超聲清洗,。但是不可使用玻璃器皿將過濾器重新裝好。

　　•建議：定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶(可以高溫滅菌),，每三個月至少清洗一次,。

　　3.1.2 泵的使用要點

　　?將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面或較高處。當在四元泵上使用鹽溶液或有機溶劑時,，建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上,，將有機溶劑接在上面的梯度閥口上，有機溶劑通道好在水或鹽溶液通道的正上面,。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出的鹽結(jié)晶,。

　　?操作泵之前，用至少兩個體積(標準脫氣機30mL,，對微脫氣機10mL)沖洗真空脫氣機,，特別是當泵關(guān)閉了一段時間后(例如,，過夜),，以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時，防止溶劑瓶內(nèi)的玻璃濾頭(過濾器)堵塞及長菌,，當濾頭表面有黑色或黃色污染層說明發(fā)生了堵塞,，應(yīng)立即清洗或更換。

　　?定期檢查排液閥的過濾白頭,。檢查方法：擰開排液閥,，以水作流動相。

　　對于標準脫氣機(G1322A),，流速5ml/min水,，若壓力大于10bar，則建議更換,。

　　對于微量脫氣機(G1379A),，流速2ml/min水,，若壓力大于5bar，則建議更換,。

　　?當使用低流速時,，檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏(用壓力測試或漏液測試。每當更換泵密封墊時排液閥慮芯也應(yīng)更換,。

　　?更換活塞密封墊時檢查活塞桿上是否有劃痕,。有劃痕的活塞將導(dǎo)致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命,。應(yīng)盡早更換有劃痕的活塞,。

　　?使用緩沖溶液時，關(guān)泵前先用水沖洗系統(tǒng),。當需要長時間使 用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時,，好選用密封墊清洗附件，以減少對密封墊及活塞桿的磨損,。

　　?如果使用了高濃度的緩沖鹽,，可以考慮用熱水(50-60℃)來沖洗鹽通道來確保沒有緩沖鹽殘留在系統(tǒng)中。

　　?更換活塞密封墊后應(yīng)按照密封墊安裝步驟對其進行磨合,，但磨合不適用于正相密封墊,。

　　?當泵頭安裝有柱塞清洗附件時，由于該附件中也有密封墊,，這樣就會增加活塞桿運動時的阻力,。所以開泵前一定要用10%異丙醇，并將其流速調(diào)至約2-3滴/分鐘使溶液流過沖洗裝置,。(對于二元泵SL,，如果不使用鹽溶液可以不開)10%異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用,。不要用其它溶劑代替,。

　　?當泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10%異丙醇，會使密封墊及活塞桿的壽命減短(二元泵SL除外),，泵頭如果發(fā)出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度如果有必要,，可以改變壓縮因子(compressibility)來達到更好的效果。

　　3.1.3 自動進樣器

　　樣品在進樣前必須經(jīng)過適當?shù)念A(yù)先處理,，需要經(jīng)過亞微米濾膜的過濾或者離心,，防止樣品中的微小顆粒堵塞管路，好使用流動相作為溶劑配制樣品,，所用溶劑應(yīng)該對樣品有較好的溶解性,。

　　針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的，有時空氣中的較大灰塵顆粒可能恰好落在針座的流路內(nèi)而引起針座的堵塞,。這時候可以嘗試卸下針座,，將它接在泵的出口上反沖，一般能解決問題,。

　　如果經(jīng)常使用緩沖溶液,，除了泵頭之外，ALS計量泵的柱塞及密封圈,，六通閥的轉(zhuǎn)子密封圈和定子密封圈應(yīng)該定期清洗,，防止有鹽的顆粒磨損ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋;使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會引起ALS故障率的增加及性能的降低。