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小鼠可溶性Endoglin（ENG/sCD105）ELISA Kit標本的采取和保存

可用作ELISA測定的標本十分廣泛,，體液（如血清）,、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份,。有些標本可直接進行測定（如血清,、尿液）,，有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標本,。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑,，而血清標本只要待血清自然凝固,、血收縮后即可取得。除特殊情況外,，在醫(yī)學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標本,。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血,，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中,，溶血標本可能會增加非特異性顯色,。
血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久,，其中的可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來,，在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存,。凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均,，應(yīng)充分混勻宜輕緩,，避免氣泡，可上下顛倒混和,，不要在混勻器上強烈振蕩,。混濁或有沉淀的血清標本應(yīng)先離心或過濾,，澄清后再檢測,。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測,，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作,，也可加入適當防腐劑。
小鼠可溶性Endoglin（ENG/sCD105）ELISA Kit試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正,。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存,。
加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚,，即加標本，加酶結(jié)合物,，加底物,。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡。 加標本一般用微量加樣器,，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染,，也可用一次性的定量塑料管加樣,。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液,，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和,。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器,，使加液過程迅速完成。
保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標本和加酶結(jié)合物后,。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間,，這一保溫過程稱為溫育（incubation）,，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當,。ELISA屬固相免疫測定,，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育,。溫育常采用的溫度有43℃、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等,。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時,，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時,，產(chǎn)物的生成可達,。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*,，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過一夜，以形成zui多的沉淀,。但因所需時間太長,，在ELISA中一般不予采用。保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,，一般均采用水浴,，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面,，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上,。若用保溫箱,，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布,，zui后將ELISA板放在濕紗布上,。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此,。無論是水浴還是濕盒溫育,，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應(yīng),，操作時的室溫應(yīng)嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育,。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可,。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確,。為保證這一點，一個人操作時,，一次不宜多于兩塊板同時測定,。
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