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實時熒光定量PCR實驗代測,，RT-PCR實驗代測,mRNA實驗代做

1.聚合酶鏈反應(yīng)（英文全稱：Polymerase Chain Reaction），簡稱PCR,。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期,，循環(huán)進行,，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強,、靈敏度高,、操作簡便、省時等特點,。它不僅可用于基因分離,、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù),。Real -Time PCR,，即實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行解析的方法,，它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì),，并通過Real -Time PCR檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)進程中的熒光信號強度進行實時監(jiān)測，zui終對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理的方法,。Real -Time PCR自1996年由美國Applied Biosystems公司推出以來,，廣泛應(yīng)用于生物研究的各個領(lǐng)域。目前主要有SYBR Green 染料,、Taqman探針法兩種,。

實時熒光定量PCR實驗代測，RT-PCR實驗代測,mRNA實驗代做

2 方法

2.1 組織總RNA的提取

（1）取組織或者細胞于1mL的Trizol的勻漿管中,，于勻漿機勻漿20sec,，立即放于冰上；

（2）置于超凈臺中,，溫育5min,，12000r/min，離心10min,；

（3）吸上清于新的1.5mL離心管中,，加入200μL的氯仿，搖勻,，室溫靜置2min,，4℃，12000r/min,，離心10min,；

（4）吸取上清于新的1.5mL離心管中，加入600μL的異丙醇,，混合均勻,，室溫靜置15min，4℃,，12000r/min,，離心15min，棄上清,；

（5）加入1mL75%的無水乙醇（750μL無水乙醇+250μL DEPC水）漂洗沉淀,，4℃，12000r/min,，離心5min,，棄上清,；

（6）加入1mL無水乙醇，漂洗沉淀,，4℃,，12000r/min，離心5min,，棄上清,，室溫干燥10min；

（7）加入40μL的DEPC水溶解RNA,，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

2.2 cDNA*條鏈的合成

2.2.1  總RNA中DNA的消除

37℃,，30min；Hold,，加1μL的EDTA,；65℃，10min,。

2.2.2 反轉(zhuǎn)錄

（1）按以下體系加入：

反應(yīng)程序：37℃,，60min；85℃,，5min,；4℃，5min,；置于-20℃保存,。

2.3 Real-time PCR擴增

將制備好的cDNA進行PCR擴增，擴增體系如下：

SYBRGreen Mix       12.5μL

上游引物F            0.5μL

下游引物R            0.5μL

ddH2O 9.5μL

cDNA模板 2μL

總體積 25μL

反應(yīng)程序：

95℃ ,，10min（95℃,，15Sec；60℃,，45Sec）×40,；95℃,15 Sec； 60℃,1min,；95℃,15 Sec,；60℃, 15 Sec；

數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析:ABI Prism 7300 SDS Software

實驗結(jié)果

提供實驗原始數(shù)據(jù)

cytochrome c mRNA擴增動力學曲線