所有產(chǎn)品僅供科研使用,，不能用于食用和醫(yī)療等

• 服務介紹

免疫熒光是一種將抗原、抗體的結合反應與形態(tài)學相結合的方法,。該法把血清學的特異性,、熒光色素的敏感性、顯微鏡檢查法集為一體,，擴大了免疫學診斷的效果,，是近代免疫學的一種重要研究手段?？贵w球蛋白標記上熒光色素,，即成為熒光抗體。這是利用某些熒光色素在一定條件下可與抗體分子結合,，但不影響抗體的免疫活性,。用熒光抗體浸染可能含抗原的細胞或組織切片，如有相應抗原存在,，則抗原與標記抗體特異性結合,，形成的免疫復合物固定于細胞上，不容易洗脫,，在熒光顯微鏡下成為發(fā)出熒光的可見物體,，可達到診斷及定位的目的。

• 實驗原理

將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上,，與其相應的抗原（或抗體）結合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。

免疫熒光細胞化學是根據(jù)抗原抗體反應的原理,，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標本,，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織,，從而確定抗原或抗體的性質,、定位，以及利用定量技術測定含量,。

三,、實驗流程

免疫熒光單標記方法

免疫熒光單標記是指只標記一種蛋白質分子，方法比較簡單，只要按照染色步驟去做,，通常不存在太多的問題,。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否,，可能會直接影響染色結果,。具體染色方法如下。

1,、所需材料與試劑

a, 培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達到60%-70%的細胞,。

b, 一抗、FITC或TRITC標記的二抗,。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預冷20 min),。

d, 封閉液。

e, 0.01mol／LPBS緩沖液,。

2,、染色方法

a, 取出培養(yǎng)有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2-3遍,。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min,。

d，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min,，抑制IgG的非特異性結合,。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

e, 去掉正常血清,，直接加入一抗,，37℃孵育1 h或4℃過夜?？贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗而定),。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min,，0.3% TritonX 5 min,，0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗,，37℃,，孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain,，0.01 mol/LPBS洗5min,，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min,，用濾紙吸干,。

i, 90%甘油(PBS配制)封片。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存,。

免疫熒光雙標記方法

免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內兩種蛋白質分子,，當懷疑某種配體與已知受體結合后可用此方法加以證明。此方法稍微復雜一些,，首先應注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體,，來自家兔,；B抗體為單克隆抗體,，來自小鼠)。其次,，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應重疊,，且盡量遠離，通?？梢赃x擇FITC和TRITC,、Alex488和TRITC、FITC和Cy5,，或Cy3和Cy5等來組合,。通常情況下，染色時兩種一抗可以同時孵育,，然后可以同時孵育兩種二抗,。但當染色結果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強時,，應考慮先孵育顏色較弱的二抗,。其他步驟同免疫熒光單標記。

四,、客戶提供

細胞株或細胞爬片,。（注：細胞爬片不宜太密；細胞必須固定,。）組織切片,，一抗

五、公司提供

實驗步驟,、實驗試劑,、樣品處理、圖片及圖片分析,，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝