免疫熒光六標(biāo)七色掃描分析全套（切片）

服務(wù)介紹：

免疫熒光六標(biāo)即利用酪胺信號(hào)放大（TSA,，Tyramide signal amplification）即TSA技術(shù)，在同一張切片上對(duì)六種蛋白同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記,，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白空間定位,，定性及半定量分析。

TSA技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在二抗上偶聯(lián)的HRP與H₂O₂的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪-氨酸殘基上,，此結(jié)合是共價(jià)結(jié)合,。而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價(jià)結(jié)合,。通過微波處理,，非共價(jià)結(jié)合的一抗二抗被打斷并洗脫掉，而共價(jià)結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍,，將靶標(biāo)通過熒光標(biāo)記顯示出來,。在檢測(cè)第二個(gè)靶標(biāo)時(shí),，相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng),。只需改變不同種類熒光染料標(biāo)記TSA即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)的標(biāo)記,。通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記，使用不同的熒光酪胺實(shí)現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?/span>

掃描的熒光圖像可以用軟件對(duì)陽性信號(hào)進(jìn)行半定量分析,，用數(shù)據(jù)去評(píng)價(jià)陽性的強(qiáng)弱,。對(duì)于陽性為單個(gè)細(xì)胞表達(dá)的指標(biāo)可以做陽性細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的分析，對(duì)于陽性為成片表達(dá)的指標(biāo)可以做陽性面積相關(guān)參數(shù)的分析,。陽性細(xì)胞數(shù)量相關(guān)參數(shù)包含：各指標(biāo)陽性細(xì)胞比率,、陽性細(xì)胞密度、陽性強(qiáng)度,。一次分析即可獲取各指標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量相關(guān)參數(shù)的三個(gè)數(shù)值,。陽性細(xì)胞數(shù)量相關(guān)參數(shù)均可用于評(píng)價(jià)陽性強(qiáng)弱多少，可根據(jù)需求進(jìn)行選擇應(yīng)用,。陽性面積相關(guān)參數(shù)包含：陽性面積比,，陽性強(qiáng)度。一次分析即可獲取各指標(biāo)陽性面積相關(guān)參數(shù)的兩個(gè)數(shù)值,。陽性面積相關(guān)參數(shù)均可用于評(píng)價(jià)陽性強(qiáng)弱多少,，可根據(jù)需求進(jìn)行選擇應(yīng)用。

送樣運(yùn)輸要求：

1,、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上，常溫保存運(yùn)輸石蠟包埋切片,。切勿冷凍結(jié)冰,，切勿固定時(shí)間過長。

2,、石蠟切片常溫保存運(yùn)輸,。

3、熒光六標(biāo)只能做石蠟包埋切片,，不能做冰凍切片和細(xì)胞爬片,。

實(shí)驗(yàn)大體流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復(fù)——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第三種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第四種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第五種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF647-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第六種一抗——孵育HRP二抗孵育iF700-TSA——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像——數(shù)據(jù)分析。

實(shí)驗(yàn)具體流程：

1,、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗,。

2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液（ PH 6.0 檸檬酸,； PH 9.0 EDTA,； PH 8.0 EDTA）的抗原修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。維持緩沖液沸騰10min左右,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）,。

3,、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液,，室溫避光孵育25 min左右,，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。

4,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

5,、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

6、加對(duì)應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。

7,、加iF440-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF440-TSA,，避光室溫孵育10min。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。

8,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片,。

9,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

10,、加第二種一抗：在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

11,、加對(duì)應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

12,、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF488-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。

13、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片。

14,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

15,、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

16、對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。

17,、加iF546-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF546-TSA,，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。

18、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片。

19,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉），一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

20,、加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

21、對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min,。

22、加iF594-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF594-TSA，避光室溫孵育10min,。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。

23,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

24、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

25,、加第五種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

26,、對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min,。

27、加iF647-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF647-TSA，避光室溫孵育10min,。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。

28,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

29、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

30,、加第六種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

31,、對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

32,、加iF700-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF700-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。

33,、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。

34,、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min,，流水沖洗10min。

35,、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。

36,、鏡檢成像：切片置于玻片數(shù)字掃描儀下掃描全景成像。

37,、數(shù)據(jù)分析：用軟件對(duì)陽性細(xì)胞數(shù)量或陽性面積進(jìn)行分析,，得到陽性細(xì)胞比率、陽性細(xì)胞密度,、陽性強(qiáng)度或陽性面積比和陽性強(qiáng)度,。