免疫熒光七標(biāo)八色（切片）

服務(wù)介紹：

免疫熒光七標(biāo)即利用酪胺信號放大（TSA,，Tyramide signal amplification）即TSA技術(shù),，在同一張切片上對七種蛋白同時進(jìn)行標(biāo)記，從而可實現(xiàn)對多種蛋白空間定位,，定性及半定量分析,。

TSA技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在二抗上偶聯(lián)的HRP與H₂O₂的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪-氨酸殘基上，此結(jié)合是共價結(jié)合,。而一抗與靶標(biāo),、二抗與一抗之間是非共價結(jié)合。通過抗體洗脫液處理,，非共價結(jié)合的一抗二抗被洗脫掉,，而共價結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍，將靶標(biāo)通過熒光標(biāo)記顯示出來,。在檢測第二個靶標(biāo)時,，相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需改變不同種類熒光染料標(biāo)記TSA即可實現(xiàn)多個靶標(biāo)的標(biāo)記,。通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記,，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?/span>

送樣運(yùn)輸要求：

1、石蠟切片常溫保存運(yùn)輸,，冰凍切片﹣20℃保存運(yùn)輸

2,、細(xì)胞爬片PFA固定15min后用無菌PBS洗滌，無菌PBS浸泡,，4℃冰袋保存運(yùn)輸?shù)綄嶒炇?/span>

實驗大體流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復(fù)——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應(yīng)的TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第二種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應(yīng)的TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第三種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應(yīng)的TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第四種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應(yīng)的TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第五種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應(yīng)的TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第六種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應(yīng)的TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第七種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應(yīng)的TSA——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像,。

（TSA熒光染料的搭配及加樣順序根據(jù)各抗體的表達(dá)情況來確定。） 

實驗具體流程：

1,、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗,。

2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液 PH 6.0 檸檬酸,； PH 9.0 EDTA,； PH 8.0 EDTA）的抗原修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),。維持緩沖液沸騰10min左右,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片,。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定，優(yōu)先推薦PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液）,。

3,、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液,，室溫避光孵育25 min左右,，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

4、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5,、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

6,、加對應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min,。

7、加對應(yīng)的TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加對應(yīng)的TSA，避光室溫孵育10min,。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

至此步驟,，第一支抗體標(biāo)記完成。

8,、抗體洗脫：切片稍甩干后,，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液,，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織,，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

9、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

10,、加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

11,、加對應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

12,、加對應(yīng)的TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加對應(yīng)的TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

至此步驟,，第二支抗體標(biāo)記完成。

備注：步驟4-7為第一支抗體標(biāo)記過程,，步驟8-12為第二支抗體標(biāo)記過程,，每輪抗體標(biāo)記只需更換不同熒光素標(biāo)記的TSA。 每標(biāo)記完一支抗體,，進(jìn)行抗體洗脫,，去除此輪標(biāo)記的一抗，二抗后,， 再繼續(xù)下一輪的抗體標(biāo)記過程,。根據(jù)熒光多標(biāo)的抗體數(shù)量，重復(fù)以上步驟,，直至完成所有的抗體標(biāo)記,，再進(jìn)入后續(xù)染核，淬滅自發(fā)熒光的步驟,。

13,、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。

14,、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min,。

15,、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。