免疫熒光四標(biāo)五色（芯片）

服務(wù)介紹：　

組織芯片的免疫熒光檢測(cè)，是將許多不同個(gè)體組織標(biāo)本以規(guī)則微陣列方式排布于同一載玻片上,，同時(shí)進(jìn)行相同指標(biāo)的免疫熒光檢測(cè),。組織芯片熒光四標(biāo)實(shí)驗(yàn)是在同一張組織芯片上對(duì)四個(gè)抗原進(jìn)行同時(shí)標(biāo)記,，從而實(shí)現(xiàn)定性，定位,，半定量分析,。 組織芯片的免疫熒光檢測(cè)，標(biāo)本體積小, 標(biāo)本信息含量大 , 一次性實(shí)驗(yàn)即可獲大量結(jié)果,。實(shí)驗(yàn)條件更易控制一致,，減少批間批內(nèi)誤差，結(jié)果更準(zhǔn)確,。

實(shí)驗(yàn)流程：

1石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗,。

2 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火8min?；?min轉(zhuǎn)中低火7min,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片,。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）

3 畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走）,，切片放入3%雙氧水溶液,，室溫避光孵育25 min，封閉內(nèi)源性的過氧化物酶,，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min

4 血清封閉:滴加BSA，封閉30min,。（一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉）

5 加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜,。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6 加對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

7 加CY3-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加CY3-TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后,，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min

8 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理，中火8min停火8min轉(zhuǎn)中低火7min,，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片,。

9 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

10 加對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min,。

11 加FITC-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加TSA,，避光室溫孵育10min. 孵育完后,，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min

12 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理,，中火8min停火8min轉(zhuǎn)中低火7min,，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片,。

13 加第三種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

14 加對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。孵育完后,，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。

15 加647-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加TSA,，避光室溫孵育10min. 孵育完后,，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min

16 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理,，中火8min?；?min轉(zhuǎn)中低火7min，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

17 加第四種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜,。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

18 加594標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的594標(biāo)記的熒光二抗覆蓋組織,，避光室溫孵育50min,。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。

19 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。

20 自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后,，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min,。

21 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。

22 鏡檢成像：切片置于掃描儀下采集圖像,。（DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm,，發(fā)藍(lán)光,；FITC激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm,，發(fā)綠光,；CY3激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm,，發(fā)紅光. 647熒光激發(fā)波長(zhǎng) 608-648nm, 發(fā)射波長(zhǎng)672-712,,，原本為正紅色，為了與CY3區(qū)分開,，我們?cè)O(shè)定為粉色光,。 594激發(fā)波長(zhǎng)594nm，發(fā)射波長(zhǎng)615nm. 我們?cè)O(shè)定為紫紅色,。

技術(shù)原理介紹：

主要原理是基于酪胺信號(hào)放大（TSA,，Tyramide signal amplification），以下簡(jiǎn)稱TSA技術(shù),。TSA是一種基于辣根過氧化物酶HRP的催化活性對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法,。技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在HRP與H2O2的作用下變?yōu)榛罨睦野罚街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪-氨酸殘基上。此結(jié)合是共價(jià)結(jié)合,，而一抗與靶標(biāo),、二抗與一抗之間是非共價(jià)結(jié)合，通過微波修復(fù)處理,，第一輪的一抗二抗被洗脫,，熒光標(biāo)記的酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍。在檢測(cè)第二個(gè)靶標(biāo)時(shí),，相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記,，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需變化不同熒光標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)的標(biāo)記,。通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記,，使用不同的熒光酪胺實(shí)現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?/span>

送樣運(yùn)輸要求：

　　1、樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上,，常溫運(yùn)輸送樣,。

　　切勿固定時(shí)間過長(zhǎng)，切勿冷凍結(jié)冰,。

　　2,、熒光四標(biāo)只能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細(xì)胞爬片,。