免疫熒光四標(biāo)五色（芯片）

服務(wù)介紹：　

組織芯片的免疫熒光檢測,，是將許多不同個體組織標(biāo)本以規(guī)則微陣列方式排布于同一載玻片上，同時進行相同指標(biāo)的免疫熒光檢測,。組織芯片熒光四標(biāo)實驗是在同一張組織芯片上對四個抗原進行同時標(biāo)記,，從而實現(xiàn)定性，定位,，半定量分析,。 組織芯片的免疫熒光檢測,，標(biāo)本體積小, 標(biāo)本信息含量大 , 一次性實驗即可獲大量結(jié)果。實驗條件更易控制一致,，減少批間批內(nèi)誤差,，結(jié)果更準(zhǔn)確。

實驗流程：

1石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗,。

2 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù),。中火8min停火8min轉(zhuǎn)中低火7min,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）

3 畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），切片放入3%雙氧水溶液,，室溫避光孵育25 min,，封閉內(nèi)源性的過氧化物酶，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min

4 血清封閉:滴加BSA,，封閉30min。（一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉）

5 加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜,。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6 加對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

7 加CY3-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加CY3-TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后,，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min

8 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理，中火8min?；?min轉(zhuǎn)中低火7min,，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

9 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

10 加對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min,。

11 加FITC-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加TSA,，避光室溫孵育10min. 孵育完后,，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

12 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理,，中火8min?；?min轉(zhuǎn)中低火7min，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片。

13 加第三種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜,。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

14 加對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。孵育完后,，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。

15 加647-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后,，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min

16 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理，中火8min?；?min轉(zhuǎn)中低火7min,，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

17 加第四種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜,。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

18 加594標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的594標(biāo)記的熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min,。孵育完后,，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

19 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,，避光室溫孵育10min。

20 自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后,，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min,，流水沖洗10min。

21 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

22 鏡檢成像：切片置于掃描儀下采集圖像,。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光,；FITC激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光,；CY3激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光. 647熒光激發(fā)波長 608-648nm, 發(fā)射波長672-712,,，原本為正紅色,，為了與CY3區(qū)分開，我們設(shè)定為粉色光,。 594激發(fā)波長594nm,，發(fā)射波長615nm. 我們設(shè)定為紫紅色。

技術(shù)原理介紹：

主要原理是基于酪胺信號放大（TSA,，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術(shù),。TSA是一種基于辣根過氧化物酶HRP的催化活性對靶蛋白或核酸進行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法,。技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在HRP與H2O2的作用下變?yōu)榛罨睦野罚街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪-氨酸殘基上,。此結(jié)合是共價結(jié)合,，而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價結(jié)合,，通過微波修復(fù)處理,，第一輪的一抗二抗被洗脫,，熒光標(biāo)記的酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍。在檢測第二個靶標(biāo)時,，相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記,，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需變化不同熒光標(biāo)記即可實現(xiàn)多個靶標(biāo)的標(biāo)記,。通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記,，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?/span>

送樣運輸要求：

　　1、樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上,，常溫運輸送樣,。

　　切勿固定時間過長，切勿冷凍結(jié)冰,。

　　2,、熒光四標(biāo)只能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細(xì)胞爬片,。