免疫熒光五標六色（切片）

服務介紹：

免疫熒光五標即利用酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技術,，在同一張切片上對五種蛋白同時進行標記，從而可實現對多種蛋白空間定位,，定性及半定量分析,。

TSA技術主要原理為熒光標記的酪胺在二抗上偶聯的HRP與H₂O₂的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠酥車牡鞍桌?氨酸殘基上，此結合是共價結合,。而一抗與靶標,、二抗與一抗之間是非共價結合。通過抗體洗脫液處理,，非共價結合的一抗二抗被洗脫掉,，而共價結合的熒光酪胺依然附著在靶標周圍，將靶標通過熒光標記顯示出來,。在檢測第二個靶標時,，相當于全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產生交叉反應,。只需改變不同種類熒光染料標記TSA即可實現多個靶標的標記,。通過多次重復免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現雙重或多重熒光染色,。

送樣運輸要求：

1,、石蠟切片常溫保存運輸，冰凍切片﹣20℃保存運輸

2,、細胞爬片PFA固定15min后用無菌PBS洗滌,，無菌PBS浸泡，4℃冰袋保存運輸到實驗室

實驗大體流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗

——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第二種一抗

——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第三種一抗

——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第四種一抗

——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第五種一抗

——孵育HRP二抗——孵育iF700-TSA——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像,。

（TSA熒光染料的搭配及加樣順序根據各抗體的表達情況來確定,。）

實驗具體流程：

1,、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2,、抗原修復：組織切片置于盛滿抗原修復緩沖液（PH 6.0 檸檬酸 PH 9.0 EDTA,； PH 8.0 EDTA）的抗原修復盒中于微波爐內進行抗原修復。維持緩沖液沸騰10min左右,，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min(修復液種類和修復條件根據組織來確定,，優(yōu)先推薦PH 6.0 檸檬酸修復液）。

3,、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走）,，切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右,，封閉內源性過氧化物酶,。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

4、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5,、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

6,、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

7,、加iF440-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF440-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

8,、抗體洗脫：切片稍甩干后，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織,，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液,，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織，37°C孵育30 min,，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。

9,、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

10,、加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

11、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。

12,、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF488-TSA,，避光室溫孵育10min。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。

13,、抗體洗脫：切片稍甩干后,，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液,，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織,，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

14、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

15、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

16,、對應的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min,。

17、加iF546-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF546-TSA，避光室溫孵育10min,。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

18,、抗體洗脫：切片稍甩干后，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織,，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液,，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織，37°C孵育30 min,，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

20,、加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

21、對應的HRP標記的二抗：將玻片置于P中上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。

22,、加iF594-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF594-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

23、抗體洗脫：切片稍甩干后,，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織,，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織,，37°C孵育30 min,，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

24,、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

25、加第五種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

26,、對應的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min,。

27、加iF700-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF700-TSA，避光室溫孵育10min,。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

28,、DAPI復染細胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

29、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內加入自發(fā)熒光淬滅劑5min,，流水沖洗10min,。

30、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。