免疫熒光五標(biāo)六色（雙寬玻片）

服務(wù)介紹：

免疫熒光五標(biāo)即利用酪胺信號(hào)放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技術(shù),，在同一張切片上對(duì)五種蛋白同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記,，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白空間定位，定性及半定量分析,。

TSA技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在二抗上偶聯(lián)的HRP與H₂O₂的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪-氨酸殘基上,，此結(jié)合是共價(jià)結(jié)合,。而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價(jià)結(jié)合。通過(guò)微波處理,，非共價(jià)結(jié)合的一抗二抗被打斷并洗脫掉,，而共價(jià)結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍,，將靶標(biāo)通過(guò)熒光標(biāo)記顯示出來(lái),。在檢測(cè)第二個(gè)靶標(biāo)時(shí)，相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記,，無(wú)需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng),。只需改變不同種類熒光染料標(biāo)記TSA即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)的標(biāo)記。通過(guò)多次重復(fù)免疫標(biāo)記,，使用不同的熒光酪胺實(shí)現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?/span>

送樣運(yùn)輸要求：

1,、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上，常溫保存運(yùn)輸石蠟包埋切片,。切勿冷凍結(jié)冰,，切勿固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

2,、石蠟切片常溫保存運(yùn)輸,。

3、TSA 熒光染料光譜數(shù)據(jù)及賽維爾掃描儀推薦搭配方式　　

實(shí)驗(yàn)大體流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復(fù)——畫(huà)圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第三種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第四種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第五種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF700-TSA——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像,。

實(shí)驗(yàn)具體流程：

1,、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-無(wú)水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2,、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液 PH 6.0 檸檬酸,； PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修復(fù)盒（WGXFHA0008）中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),。維持緩沖液沸騰10min左右,，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片,。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來(lái)確定,，優(yōu)先推薦PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液）,。

3、畫(huà)圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫(huà)圈（防止試劑流走），切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液,，室溫避光孵育25 min左右,，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。

4、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉,，一抗其它來(lái)源的用3%BSA(GC305006)封閉。

5,、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

6,、加對(duì)應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

7,、加iF440-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF440-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。

8、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā),，切勿干片。

9,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉，一抗其它來(lái)源的用3%BSA(GC305006)封閉,。

10,、加第二種一抗：在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

11,、加對(duì)應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min,。

12、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF488-TSA，避光室溫孵育10min,。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。

13,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā),，切勿干片,。

14、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉,，一抗其它來(lái)源的用3%BSA(GC305006)封閉。

15,、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

16,、對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

17,、加iF546-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF546-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。

18、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā),，切勿干片,。

19、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉，一抗其它來(lái)源的用3%BSA(GC305006)封閉,。

20,、加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

21、對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。

22,、加iF594-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF594-TSA,，避光室溫孵育10min。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。

23,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片,。

24,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉,，一抗其它來(lái)源的用3%BSA(GC305006)封閉,。

25、加第五種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

26,、對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min,。

27,、加iF700-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF700-TSA,，避光室溫孵育10min。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。

28,、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。

29,、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min,，流水沖洗10min。

30,、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。