免疫熒光五標(biāo)六色（芯片）

服務(wù)介紹：　

組織芯片的免疫熒光檢測,，是將許多不同個體組織標(biāo)本以規(guī)則微陣列方式排布于同一載玻片上,，同時進(jìn)行相同指標(biāo)的免疫熒光檢測。組織芯片熒光五標(biāo)實驗是在同一張組織芯片上對五個抗原進(jìn)行同時標(biāo)記,，從而實現(xiàn)定性,，定位，半定量分析,。 組織芯片的免疫熒光檢測,，標(biāo)本體積小, 標(biāo)本信息含量大 , 一次性實驗即可獲大量結(jié)果。實驗條件更易控制一致,，減少批間批內(nèi)誤差,，結(jié)果更準(zhǔn)確。

送樣運(yùn)輸要求：

1,、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上,，常溫保存運(yùn)輸石蠟包埋切片。切勿冷凍結(jié)冰,，切勿固定時間過長,。

2、石蠟切片常溫保存運(yùn)輸,。

3,、熒光四標(biāo)只能做石蠟包埋切片,，不能做冰凍切片和細(xì)胞爬片。

實驗大體流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復(fù)——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第三種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第四種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第五種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF700-TSA——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像,。

實驗具體流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗,。

2,、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液（ PH 6.0 檸檬酸； PH 9.0 EDTA,；PH 8.0 EDTA）的抗原修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),。維持緩沖液沸騰10min左右，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定,，優(yōu)先推薦PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液）,。

3、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走）,，切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液,，室溫避光孵育25 min左右，封閉內(nèi)源性過氧化物酶,。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床晃動洗滌3次,，每次5min。

4,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

5,、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

6、加對應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。

7,、加iF440-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF440-TSA,，避光室溫孵育10min。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。

8,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片,。

9,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

10、加第二種一抗：在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

11、加對應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。

12,、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF488-TSA,，避光室溫孵育10min。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。

13,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片,。

14,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

15、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

16、對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。

17,、加iF546-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF546-TSA，避光室溫孵育10min,。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

18,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

19、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

20,、加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

21,、對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

22,、加iF594-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF594-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

23,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

24、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

25,、加第五種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

26,、對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

27,、加iF700-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF700-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

28、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液,，避光室溫孵育10min,。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

29,、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min,。

30,、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。

31、鏡檢成像：切片置于玻片數(shù)字掃描儀下掃描全景成像。