免疫熒光五標(biāo)六色掃描全套（切片）

服務(wù)介紹：

免疫熒光五標(biāo)即利用酪胺信號放大（TSA,，Tyramide signal amplification）即TSA技術(shù),，在同一張切片上對五種蛋白同時進(jìn)行標(biāo)記，從而可實現(xiàn)對多種蛋白空間定位,，定性及半定量分析,。

TSA技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在二抗上偶聯(lián)的HRP與H₂O₂的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪-氨酸殘基上，此結(jié)合是共價結(jié)合,。而一抗與靶標(biāo),、二抗與一抗之間是非共價結(jié)合。通過微波處理,，非共價結(jié)合的一抗二抗被打斷并洗脫掉,，而共價結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍，將靶標(biāo)通過熒光標(biāo)記顯示出來,。在檢測第二個靶標(biāo)時,，相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng),。只需改變不同種類熒光染料標(biāo)記TSA即可實現(xiàn)多個靶標(biāo)的標(biāo)記,。通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?/span>

送樣運輸要求：

1,、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上,，常溫保存運輸石蠟包埋切片。切勿冷凍結(jié)冰,，切勿固定時間過長,。

2,、石蠟切片常溫保存運輸,。

3、熒光五標(biāo)只能做石蠟包埋切片,，不能做冰凍切片和細(xì)胞爬片,。

實驗大體流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復(fù)——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第三種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第四種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第五種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF700-TSA——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像,。

實驗具體流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗,。

2,、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液（ PH 6.0 檸檬酸；PH 9.0 EDTA,； PH 8.0 EDTA）的抗原修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),。維持緩沖液沸騰10min左右，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）,。

3,、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液,，室溫避光孵育25 min左右,，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

4、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5,、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

6,、加對應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

7,、加iF440-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF440-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

8,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

9、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

10,、加第二種一抗：在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

11,、加對應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min,。

12、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF488-TSA，避光室溫孵育10min,。 孵育完后,，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

13,、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

14、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

15,、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

16,、對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

17,、加iF546-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF546-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

18、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片。

19,、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉,。

20,、加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

21,、對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min,。

22,、加iF594-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF594-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

23、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。

24、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min,。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

25,、加第五種一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）,。

26,、對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,，室溫孵育50min。

27,、加iF700-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF700-TSA,，避光室溫孵育10min,。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。

28、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液,，避光室溫孵育10min,。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

29,、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min,。

30,、封片：將玻片置于PH7.4 PBS在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。

31、鏡檢成像：切片置于玻片數(shù)字掃描儀下掃描全景成像,。