原位雜交（BCIP/NBT）

服務(wù)介紹：

原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程,。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行,。

實(shí)驗(yàn)流程：

1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h,。

2,、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋,。

3,、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片,，62°烤箱烤片2h,。

4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗,。

5,、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘,，自然冷卻,。后基因筆畫圈,，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min,。純水沖洗后PBS洗3次×5min,。

6、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液,，37°C孵育1h,。

7、雜交：傾去預(yù)雜交液,，滴加含探針雜交液,恒溫箱 37度雜交過(guò)夜,。

8、雜交后洗滌：洗去雜交液,，2×SSC,，37°C 洗10min，1×SSC,，37°C洗2×5min,，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,，可以增加甲酰胺洗滌,。

9、滴加封閉液：滴加封閉血清正常兔血清,。室溫30min,。

10、滴加鼠抗地-高辛標(biāo)記堿性磷酸酶(anti-DIG-AP)：傾去封閉液,，滴加anti-DIG-AP,。37°C孵育40min，后TBS洗4次×5min,。

11,、BCIP/NBT顯色：滴加BCIP/NBT顯色液，顯微鏡觀察陽(yáng)性,。后純水沖洗,。

12、復(fù)染細(xì)胞核：滴加核固紅染液,，染核至合適程度后純水沖洗,。

13、封片：自然風(fēng)干后,，中性樹(shù)膠封片,。

14、顯微鏡檢,，圖像采集分析,。

結(jié)果判讀：

陽(yáng)性為藍(lán)色,，藍(lán)紫色。細(xì)胞核為紅色,。

送樣要求：

1,、切片前處理要求：新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織,，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定,，4℃低溫保存運(yùn)輸，切勿冷凍結(jié)冰,，盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn),，固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響核酸檢出率；

2,、冰凍切片：冰凍切片-20℃運(yùn)輸,；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運(yùn)輸,；

4,、細(xì)胞爬片：細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無(wú)酶PBS,，密封,，4℃運(yùn)輸。 

單據(jù)填寫：

1,、探針合成：需提供待測(cè)目的基因序列或基因登錄號(hào),、所需標(biāo)記類型；

2,、自帶探針需告知完整探針信息,；

3、寫明檢測(cè)要求,。