原位雜交（DAB）

服務(wù)介紹：

原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)流程：

1,、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

2,、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟,，包埋,。

3、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片,，攤片機(jī)撈片,，62°烤箱烤片2h。

4,、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗,。

5、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短,，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘,，自然冷卻。后基因筆畫(huà)圈,，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性,，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min,。

6,、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min,，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。

7,、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液,，37°C孵育1h。

8,、雜交：傾去預(yù)雜交液,，滴加含探針雜交液, 恒溫箱 37度雜交過(guò)夜。

9,、雜交后洗滌：洗去雜交液,，2×SSC，37°C 洗10min,，1×SSC，37°C洗2×5min,，0.5×SSC室溫洗10min,。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌,。

10,、滴加封閉液：滴加封閉血清正常兔血清。室溫30min,。

11,、滴加鼠抗地-高辛標(biāo)記過(guò)氧化物酶(anti-DIG-HRP)：傾去封閉液,，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min,，后PBS洗4次×5min,。

12、DAB顯色：切片稍甩干后,，在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色,，純水沖洗切片終止顯色,。

13、復(fù)染細(xì)胞核：Harris蘇木素復(fù)染3min左右,，自來(lái)水洗,，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水洗,，氨水返藍(lán),，流水沖洗。

14,、脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I(xiàn) 6min—100%酒精I(xiàn)I 6min-正丁醇6min—二甲苯透明,，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，中性樹(shù)膠封片,。

15,、顯微鏡檢，圖像采集分析,。

結(jié)果判讀：

陽(yáng)性為棕黃色,，細(xì)胞核為藍(lán)色。 

送樣要求：

1,、切片前處理要求：新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片,；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定,，4℃低溫保存運(yùn)輸,，切勿冷凍結(jié)冰，盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn),，固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響核酸檢出率,；

2、冰凍切片：冰凍切片-20℃運(yùn)輸,；

3,、石蠟切片：石蠟切片常溫運(yùn)輸；

4,、細(xì)胞爬片：細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后,，換無(wú)酶PBS,，密封，4℃運(yùn)輸,。 

單據(jù)填寫：

1,、探針合成：需提供待測(cè)目的基因序列或基因登錄號(hào)、所需標(biāo)記類型,；

2,、自帶探針需告知完整探針信息；

3,、寫明檢測(cè)要求,。