原位雜交（FISH,、IF雙染）

服務(wù)介紹：

原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程,。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行,。IF即免疫熒光，可檢測組織或細(xì)胞中某蛋白的表達(dá)情況及定位,。

原位雜交(FISH,、IF雙標(biāo))可以檢測靶基因與靶蛋白的共定位情況。

實(shí)驗(yàn)流程：

石蠟切片熒光探針原位雜交與免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟

1,、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

2,、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟,，包埋。

3,、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片,，攤片機(jī)撈片，62°烤箱烤片2h,。

4,、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗,。

5、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長短,，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘,，自然冷卻。后基因筆畫圈,，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性,，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°C消化20-30min。純水沖洗后PBS洗3次×5min,。

6,、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液,，37°C孵育1h,。

7、雜交：傾去預(yù)雜交液,，滴加含探針雜交液,恒溫箱37度雜交過夜,。

8、雜交后洗滌：洗去雜交液,，2×SSC,，37°C 洗10min，1×SSC,，37°C洗2×5min,，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,，可以增加甲酰胺洗滌,。

9、孵育一抗：滴加一抗,，PBS稀釋,。4°過夜。后PBS洗3×5min,。

10,、孵育二抗：滴加相應(yīng)二抗，室溫孵育50min,。后PBS洗3×5min,。

11、DAPI復(fù)染核：切片滴加DAPI染液,，避光孵育8min,，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

12,、鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。(紫外激發(fā)波長330-380nm,，發(fā)射波長420nm,發(fā)藍(lán)光;FAM(488)綠光激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm,，發(fā)綠光;CY3紅光激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光,。) 　　

送樣要求：

1,、切片前處理要求：新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織,，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定,，4℃低溫保存運(yùn)輸，切勿冷凍結(jié)冰,，盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn),，固定時(shí)間過長影響核酸檢出率；

2,、冰凍切片：冰凍切片-20℃運(yùn)輸,；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運(yùn)輸,；

4,、細(xì)胞爬片：細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS,，密封,，4℃運(yùn)輸。 

單據(jù)填寫：

1,、探針合成：需提供待測目的基因序列或基因登錄號(hào),、所需標(biāo)記類型；

2,、自帶探針需告知完整探針信息,；

3、寫明檢測要求,。