瓊脂糖-重組大消化鏈球菌蛋白L親和填料

1.  產(chǎn)品介紹

（Recombinant Peptostreptococcus magnus Protein L,，簡(jiǎn)稱r-PPL,、蛋白L）偶聯(lián)在高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠上的一種親和純化介質(zhì)。大消化鏈球菌蛋白L（PPL）能與抗體的κ輕鏈結(jié)合而不會(huì)影響抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn),，這一特性使其與結(jié)合抗體Fc區(qū)域的蛋白A,、蛋白G相比，能更廣泛地結(jié)合各種來(lái)源及亞類的抗體,。如人類的IgG,、IgM、IgA,、IgE,、IgD，以及含κ輕鏈（人類1、3,、4型,，小鼠1型）的Fab、scFv 等抗體片段,。但不能與重鏈,、λ輕鏈、κ輕鏈（2型）結(jié)合,，因而本產(chǎn)品不能純化牛,、山羊、綿羊,、雞來(lái)源的抗體,。

2 、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測(cè)試條件為：10%流穿,，6 min 停留時(shí)間,；c 推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下2~6 min 停留時(shí)間的使用條件，并非只能在該流速范圍內(nèi)工作,；d 10 cm 柱高下的最大測(cè)試流速,。

3、 不同配基與抗體的結(jié)合力

蛋白L與蛋白A,、蛋白G對(duì)各類抗體的親和力差異如下表所示,。

注：-表示不結(jié)合；+表示微弱結(jié)合,；++表示中等結(jié)合,；+++表示很強(qiáng)結(jié)合；NA表示暫無(wú)數(shù)據(jù),。能用于親和純化的抗體一般需要中等以上的結(jié)合力。

4 ,、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí),，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理,。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積,，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積,。ProLNUPharoseFF的壓縮比為1.15,。為使達(dá)到裝柱比，可通過(guò)柱頭下壓的方法,，也可以通過(guò)高流速壓柱,。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體,，并用約3倍填料體積的純化水洗滌,，重復(fù)3次，以除去保存液,。也有用20%乙醇+0.4M NaCl作為裝柱液的應(yīng)用案例,。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液,，制成50~75 v%的裝柱填料懸液,，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液,，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣,，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭,，調(diào)整柱子使其垂直于地面,。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器），為避免引入氣泡,，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下,。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿,，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降）,，待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器，裝上上柱頭,，并將柱頭下降至界面處,；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa）,，繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高,。停泵，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭,，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭,，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置，旋緊柱頭,，裝柱完成,。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料,。

4.2 柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后,、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱因子（As）來(lái)評(píng)價(jià),。柱效測(cè)定可以采用丙酮或者NaCl作為樣品進(jìn)行,，按照下表配制樣品溶液和流動(dòng)相。

根據(jù)UV 或者電導(dǎo)率曲線計(jì)算理論塔板高度（HETP）,、理論塔板數(shù)（N）和非對(duì)稱因子（As）,，公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L為柱高；VR為保留體積,；Wh為半高峰寬,；a為在10%峰高處的第一個(gè)半峰寬；b為在10%峰高處的第二個(gè)半峰寬,。

一般來(lái)說(shuō),，HETP的數(shù)值應(yīng)小于填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3，D50為填料的平均粒徑）,，As應(yīng)在0.8~1.5之間,。

4.3 平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB緩沖液（20 mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系,。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液,，記為緩沖液A。

在上樣前,，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱,，該過(guò)程通常需要5~10個(gè)柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo),、pH等檢測(cè)信號(hào)參數(shù)不變且與緩沖液A對(duì)應(yīng)為準(zhǔn),。

上樣量可按“mg 目標(biāo)蛋白/mL填料"來(lái)設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%,，例如ProL NUPharose FF產(chǎn)品對(duì)人IgG的DBC10%為~40mg/mL,，上樣量可控制為20~32mg/mL。在條件篩選階段,，也可以降低上樣品,，觀察結(jié)合,、特異性和洗脫情況。上樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行離心（10000 g 以上）,、過(guò)（0.22或0.45μm）處理，以免堵塞色譜柱,。

上樣后需要3~10個(gè)柱體積的緩沖液A再平衡層析柱,。

4.4 洗脫與再生（Elution & Regeneration）

最-常用的洗脫方式為pH=2.5~3.0的甘-氨酸、檸檬酸鹽或乙酸鹽,，該條件可基本將抗體完-全洗脫,。但該pH較低，可能會(huì)使一些抗體失活或聚集,，在條件篩選階段可逐步降低pH,，篩選出收率可接受、抗體不失活或不聚焦的最高pH,。也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩沖液中,，中和至中性，以縮短低pH條件的接觸時(shí)間,。洗脫之后,，可用 5~10個(gè)柱體積的洗脫液對(duì)色譜柱進(jìn)行再生。

4.5 在位清洗（CIP）

ProLNUPharose FF可耐受15 mM NaOH的CIP過(guò)程（至少2個(gè)柱體積,，10~30 min的接觸時(shí)間）,，再立即用5個(gè)柱體積以上的緩沖液A平衡。

多次使用后會(huì)有沉淀蛋白,，強(qiáng)疏水性蛋白,，脂蛋白，脂質(zhì)體等非特異吸附凝膠上,，可以用0.1%去垢劑短時(shí)間清洗,，如0.1% Triton X-100 清洗2個(gè)柱體積，立即用結(jié)合緩沖液洗5-10個(gè)柱體積,。也可以用70%乙醇清洗作同樣清洗,。

4.6 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過(guò)后可繼續(xù)用20%乙醇保存,。保存溫度在2~8℃為宜,，不可凍存。