瓊脂糖-重組耐堿蛋白A 親和填料

1 ,、產(chǎn)品介紹

rat-PANUPharoseFF是一款抗體親和填料,，FF為Fast Flow的縮寫(xiě)，意味該填料可在高流速下工作,。

重組耐堿蛋白A配基由大腸桿菌表達(dá),，不含動(dòng)物來(lái)源。rat-PANUPharoseFF的基球與配基通過(guò)單點(diǎn)偶聯(lián)而成,，加之基因工程改造,，其對(duì)人IgG 的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量穩(wěn)定在45mg/mL，可耐受0.1~0.5M濃度的NaOH溶液清洗和去除熱源,，純化過(guò)程具備配基掉落少,、宿主細(xì)胞蛋白含量低的特點(diǎn)。相較于ProA NUPharose FF,，本產(chǎn)品保持了對(duì)人,、小 鼠、大鼠,、兔,、牛等等來(lái)源的多種類型和亞型的抗體有親和作用，可從腹水,、血清,、細(xì) 胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞抽提物中分離和純化多種哺乳動(dòng)物不同亞型的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白，可滿足不同規(guī)模的研究或生產(chǎn)嚴(yán)格的清潔要求,。

2 ,、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

 注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測(cè)試條件為：10%流穿，6 min 停留時(shí)間,；c 推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下2~6 min 停留時(shí)間的使用條件,，并非只能在該流速范圍內(nèi)工作；d 10 cm 柱高下的最大測(cè)試流速,。

3 ,、使用方法參考

3.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí)，填料的色譜柱裝填方法,。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積,，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）,。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。rat-PANUPharoseFF的壓縮比為1.15,。為使達(dá)到裝柱比,，可通過(guò)柱頭下壓的方法，也可以通過(guò)高流速壓柱,。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積,，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌,，重復(fù)3次,，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液,，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻,。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液,，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水,，擰緊下堵頭,，調(diào)整柱子使其垂直于地面,。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器），為避免引入氣泡,，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下,。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿,，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降）,，待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器，裝上上柱頭,，并將柱頭下降至界面處,；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa）,，繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵,，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭,，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置,，旋緊柱頭,，裝柱完成。裝柱完成后,，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料,。

3.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量,。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱因子（As）來(lái)評(píng)價(jià),。柱效測(cè)定可以采用丙酮或者NaCl作為樣品進(jìn)行，按照下表配制樣品溶液和流動(dòng)相,。

根據(jù) UV 或者電導(dǎo)率曲線計(jì)算理論塔板高度（HETP）,、理論塔板數(shù)（N）和非對(duì)稱 因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2As=a/b

其中：L為柱高,；VR為保留體積,；Wh為半高峰寬；a為在10%峰高處的第一個(gè)半峰寬,；b為在10%峰高處的第二個(gè)半峰寬,。

一般來(lái)說(shuō)，HETP的數(shù)值應(yīng)小于填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3,，D50為填 料的平均粒徑）,，As應(yīng)在0.8~1.5 之間,。

3.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB緩沖液（20mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系,。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液,，記為緩沖液 A。

在上樣前,，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱,，該過(guò)程通常需要5~10個(gè)柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo),、pH等檢測(cè)信號(hào)參數(shù)不變且與緩沖液A對(duì)應(yīng)為準(zhǔn),。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL填料"來(lái)設(shè)定,，通常為DBC10%的50~80%,，例如rat-PANUPharoseFF產(chǎn)品對(duì)人IgG的DBC10%為~45mg/mL，上樣量可控制為23~36mg/mL,。在條件篩選階段,，也可以降低上樣品，觀察結(jié)合,、特異性和洗脫情況,。上樣前需要對(duì)樣 品進(jìn)行離心（10000 g 以上）、過(guò)濾（0.22或0.45μm）處理,，以免堵塞色譜柱,。

上樣后需要3~10個(gè)柱體積的緩沖液A再平衡層析柱。

3.4  洗脫與再生（Elution & Regeneration）

最-常用的洗脫方式為pH=2.5~4.0的甘-氨酸,、檸檬酸鹽或乙酸鹽,，該條件可基本將抗體完-全洗脫。但該pH較低,，可能會(huì)使一些抗體失活或聚集,，在條件篩選階段可逐步降低pH，篩選出收率可接受,、抗體不失活或不聚焦的最高pH,。也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩沖液中，中和至中性,，以縮短低pH條件的接觸時(shí)間,。洗脫之后，可用5~10個(gè)柱體積的洗脫液對(duì)色譜柱進(jìn)行再生,。

3.5  在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱壓升高,，或有蛋白與填料強(qiáng)烈結(jié)合無(wú)法洗脫，或有沉淀,、變性蛋白時(shí),，需要對(duì)填料進(jìn)行在位清洗,，可采用0.1~0.5 M 濃度的NaOH去除雜質(zhì)，反向清洗效果更佳,。

3.6  填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇,，使用過(guò)后可繼續(xù)用20%乙醇保存,。保存溫度在2~8℃ 為宜，不可凍存,。