瓊脂糖-重組耐堿蛋白A 親和填料

1 、產(chǎn)品介紹

rat-PANUPharoseFF是一款抗體親和填料,，FF為Fast Flow的縮寫,，意味該填料可在高流速下工作。

重組耐堿蛋白A配基由大腸桿菌表達,，不含動物來源,。rat-PANUPharoseFF的基球與配基通過單點偶聯(lián)而成，加之基因工程改造,，其對人IgG 的動態(tài)結(jié)合載量穩(wěn)定在45mg/mL,，可耐受0.1~0.5M濃度的NaOH溶液清洗和去除熱源，純化過程具備配基掉落少,、宿主細(xì)胞蛋白含量低的特點,。相較于ProA NUPharose FF,，本產(chǎn)品保持了對人,、小 鼠,、大鼠、兔,、牛等等來源的多種類型和亞型的抗體有親和作用,，可從腹水、血清,、細(xì) 胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞抽提物中分離和純化多種哺乳動物不同亞型的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白,，可滿足不同規(guī)模的研究或生產(chǎn)嚴(yán)格的清潔要求。

2 ,、產(chǎn)品特點與技術(shù)指標(biāo)

 注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測試條件為：10%流穿,，6 min 停留時間；c 推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下2~6 min 停留時間的使用條件,，并非只能在該流速范圍內(nèi)工作,；d 10 cm 柱高下的最大測試流速。

3 ,、使用方法參考

3.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時,，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,，液體最好做脫氣處理,。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）,。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積,。rat-PANUPharoseFF的壓縮比為1.15。為使達到裝柱比,，可通過柱頭下壓的方法,，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積,，抽濾除去液體,，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次,，以除去保存液,。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液,，使用前攪勻,。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣,，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水,，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面,。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器）,，為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下,。將所有填料加入后,，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接,。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器,，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處,；通過高流速（推薦流速見下表,，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標(biāo)記界面穩(wěn)定時的柱高,。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭,，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭,，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置，旋緊柱頭,，裝柱完成,。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料,。

3.2  柱效測定和評價

完成裝柱后,、使用前可通過柱效測定和評價可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價,。柱效測定可以采用丙酮或者NaCl作為樣品進行,，按照下表配制樣品溶液和流動相。

根據(jù) UV 或者電導(dǎo)率曲線計算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數(shù)（N）和非對稱 因子（As）,，公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2As=a/b

其中：L為柱高,；VR為保留體積；Wh為半高峰寬,；a為在10%峰高處的第一個半峰寬；b為在10%峰高處的第二個半峰寬,。

一般來說,，HETP的數(shù)值應(yīng)小于填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3，D50為填 料的平均粒徑）,，As應(yīng)在0.8~1.5 之間,。

3.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB緩沖液（20mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系,。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液,，記為緩沖液 A。

在上樣前,，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱,，該過程通常需要5~10個柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo),、pH等檢測信號參數(shù)不變且與緩沖液A對應(yīng)為準(zhǔn),。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL填料"來設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%,，例如rat-PANUPharoseFF產(chǎn)品對人IgG的DBC10%為~45mg/mL,，上樣量可控制為23~36mg/mL。在條件篩選階段,，也可以降低上樣品,，觀察結(jié)合、特異性和洗脫情況,。上樣前需要對樣 品進行離心（10000 g 以上）,、過濾（0.22或0.45μm）處理，以免堵塞色譜柱,。

上樣后需要3~10個柱體積的緩沖液A再平衡層析柱,。

3.4  洗脫與再生（Elution & Regeneration）

最-常用的洗脫方式為pH=2.5~4.0的甘-氨酸、檸檬酸鹽或乙酸鹽,，該條件可基本將抗體完-全洗脫,。但該pH較低，可能會使一些抗體失活或聚集,，在條件篩選階段可逐步降低pH,，篩選出收率可接受、抗體不失活或不聚焦的最高pH。也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩沖液中,，中和至中性,，以縮短低pH條件的接觸時間。洗脫之后,，可用5~10個柱體積的洗脫液對色譜柱進行再生,。

3.5  在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱壓升高，或有蛋白與填料強烈結(jié)合無法洗脫,，或有沉淀,、變性蛋白時，需要對填料進行在位清洗,，可采用0.1~0.5 M 濃度的NaOH去除雜質(zhì),，反向清洗效果更佳。

3.6  填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存,。保存溫度在2~8℃ 為宜,，不可凍存。