D-生物-素-瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

Biotin NUPharose FF 是一種將D-生物-素鍵合在NUPharose瓊脂糖基球上形成的親和層析分離介質(zhì),。該介質(zhì)中的生物-素配基能高度特異性結(jié)合親和素,、鏈霉親和素，親和力非常高，可用于親和素,、鏈霉親和素及其偶聯(lián)物的固定化,，固定化后的產(chǎn)品可應(yīng)用于診斷檢測(cè)，蛋白純化等,。也可直接用于削弱親和力的親和素,、鏈霉親和素突變體的純化。

2 ,、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測(cè)試條件為：10%流穿，6 min 停留時(shí)間,。

3 ,、生物-素填料親和原理

Biotin NUPharose FF填料是在NUPharose 瓊脂糖凝膠微球骨架上修飾D-生物-素而成（圖1a）。D-生物-素與鏈霉親和素之間的親和力非常高,，其解離常數(shù)在10?14mol/L數(shù)量級(jí),，是自然界最-強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一。

本產(chǎn)品特異性結(jié)合鏈霉親和素后非常穩(wěn)定,，只有在苛刻的條件下,，例如 2%SDS的變性條件才能將鏈霉親和素解離。因此Biotin NUPharose FF適用于親和素,、鏈霉親和素及其偶聯(lián)物的固定化,，固定化后的產(chǎn)品可應(yīng)用于診斷檢測(cè)、蛋白純化等,。

另外一方面,，一些鏈霉親和素的突變體與D-生物-素之間的親和力大幅減弱，使得突變體與D-生物-素的特異性結(jié)合是可逆的（圖1c）,，因而可以用Biotin NUPharose FF來(lái)純化鏈霉親和素突變體（圖2）,。

4 、使用方法參考 

4.1  色譜柱裝填以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí),，填料的色譜柱裝填方法,。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積,，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱(chēng)壓縮因子）,。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。Biotin NUPharose FF 的壓縮比為1.15 ,。為使達(dá)到裝柱比,，可通過(guò)柱頭下壓的方法，也可以通過(guò)高流速壓柱,。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積,，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌,，重復(fù)3次,，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液,，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻,。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液,，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水,，擰緊下堵頭,，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器）,，為避免引入氣泡,，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后,，用裝柱液將裝柱器加滿(mǎn),，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接,。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉 降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器,，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處,；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表,，注意柱壓不超過(guò)0.3 MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高,。停泵,，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭,，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置,，旋緊柱頭，裝柱完成,。裝柱完成后,，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后,、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量,。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱(chēng)因子（As）來(lái)評(píng)價(jià)。

4.3  推薦緩沖液

推薦用以下緩沖液結(jié)合鏈霉親和素或者純化鏈霉親和素突變體,。

結(jié)合緩沖液：20 mM Tris-HCl,，150 mM NaCl，1 mM EDTA,，pH8.0

洗脫緩沖液：結(jié)合緩沖液+10~50 mM D-生物-素再生緩沖液：0.1 M NaOH

4.4 樣品純化

（1）平衡：再用結(jié)合緩沖液平衡5個(gè)柱體積,，建議流速為100~150 cm/h。

（2）上樣：將準(zhǔn)備好的樣品上柱,，建議流速為20~ 00cm/h ,，可根據(jù)實(shí)際結(jié)合情況選擇流速，能獲得較好的效果,。上柱的樣品應(yīng)盡量保持與結(jié)合緩沖液一致,。通常可用透析,、超濾,、稀釋等方法處理樣品。并且上柱前應(yīng)過(guò) 0.45μm 濾膜或高速離心去除 不溶物,。

（3）再平衡：上樣后用結(jié)合緩沖液平衡5~10個(gè)柱體積,，或平衡至基線，洗去 雜質(zhì),，推薦流速為100~150 cm/h,。

（4）洗脫：用洗脫緩沖液洗6~10個(gè)柱體積，建議流速為100~150 cm/h,根據(jù)需要置換緩沖液,。

（5）NaOH再生：洗脫目的蛋白后的柱子用純水清洗3-5個(gè)柱體積,，并用0.1 M NaOH 再生 3-5 個(gè)柱體積，再用純水清洗至中性,，用 20%乙醇保存柱子,，或用結(jié)合緩沖液平衡后進(jìn)行下一次純化，建議流速為100~150 cm/h,。

4.5 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇,，使用過(guò)后可繼續(xù)用20%乙醇保存,。保存溫度在2~8 ℃為宜，不可凍存,。