大豆胰蛋-白酶抑制劑-瓊脂糖

1 ,、產(chǎn)品介紹

TI NUPharose FF是一種將大豆胰蛋-白酶抑制劑（Soybean Trypsin Inhibitor，STI）鍵合在瓊脂糖凝膠微球上形成的生物親和層析分離介質(zhì),。該產(chǎn)品保留了瓊脂糖極-好的親水性及大網(wǎng)架結(jié)構(gòu),，與生物活性大分子有很好的相容性，具有載量高,，非特異性吸附少,，流速快等特點，主要用于胰蛋-白酶,、糜蛋-白酶,、凝血X因子等絲-氨酸蛋白酶的提取和純化，也可以用于腸激酶的去除,。

2 ,、產(chǎn)品特點與技術(shù)指標

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；b 10 cm 柱高下的最大測試流速,。

3 、使用方法參考

 3.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時,，填料的色譜柱裝填方法,。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理,。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積,，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積,。STI NUPharose FF的壓縮比為~1.15,。為使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法,，也可以通過高流速壓柱,。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽去液體,，并用約3倍填料體積的純化水洗滌,，重復(fù)3次，以除去保存液,。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉(zhuǎn)移到適當?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體積分數(shù)為67%）,，使用前攪勻,。

（5）裝填前準備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣,，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水,，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面,。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器）,，為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下,。將所有填料加入后,，用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接,。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器,，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處,；通過高流速（推薦流速見下表,，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標記界面穩(wěn)定時的柱高,。停泵,，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭,，下壓柱頭至標記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置,，旋緊柱頭，裝柱完成,。裝柱完成后,，需用高流 速平衡柱內(nèi)的填料。

3.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認層析柱裝填質(zhì)量,。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價,。

3.3 平衡與上樣

在上樣前，可用上樣緩沖液（平衡緩沖液）在操作流速下平衡層析柱,，觀察檢測器的變化,，直到電導(dǎo)、pH 等參數(shù)不變,，一般需5~10個CV（柱體積）,。上樣量根據(jù)樣品的性質(zhì)和層析介質(zhì)的量進行選擇，可在預(yù)實驗中確定,，例如靜態(tài)吸附實驗,。

上樣前需通過透析或超濾將樣品溶劑置換為上樣緩沖液（平衡緩沖液），然后澄清過濾（0.45,、0.22μm）,。

上樣緩沖液pH 通常為7.0~8.0，可參考使用如下上樣緩沖液：50mM Tris-HCl,，100~500 mM NaCl,，pH8.0,。

在去除腸激酶的應(yīng)用中,，目標蛋白在流穿中,，腸激酶被結(jié)合在柱上,。

3.4 淋洗

用 2-5 個柱體積的平衡緩沖液沖洗上樣后的層析柱,，觀察檢測器的變化,，直到電導(dǎo),、 pH 等參數(shù)不變,，此時未結(jié)合的組分被清洗出去。

3.5 洗脫

親和層析柱的洗脫可用恒定洗脫,、梯度洗脫或者階躍洗脫。一般用酸性緩沖液進行洗脫,。推薦的洗脫緩沖液為：100 mM Glycine-HCl,，500mM NaCl,，pH3.0。洗脫后的樣品應(yīng)盡快調(diào)節(jié)至中性,，比如加入1/10體積的2M Tris-HCl (pH8.0)。

3.6  再生與在位清洗（CIP）

可以用平衡緩沖液和洗脫緩沖液反復(fù)清洗,，不耐受強酸,、強堿、強有機溶劑的清洗,。

3.7  填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇,，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~8 ℃為宜,，不可凍存,。