肝素-瓊脂糖

1 ,、產(chǎn)品介紹

Heparin NUPharose FF和Heparin NUPharose HP是肝素親和填料,，FF為Fast Flow的縮寫，具備快流速的特點(diǎn),，可用于快速純化蛋白質(zhì),，適用性廣，易于放大,。HP為High Performance的縮寫,，具備分辨率高的特點(diǎn)。肝素親和的原理較為復(fù)雜,，一般認(rèn)為肝素與蛋白的結(jié)合 是離子相互作用,、氫鍵與范德華力等多種驅(qū)動(dòng)力共同作用的結(jié)果。肝素填料主要用于凝-血酶III,、凝血-因子,、脂蛋白、酯酶,、激素,、干擾素等的分離純化。也有文獻(xiàn)報(bào)道將肝素填料用于外泌體的純化,。

2 ,、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測(cè)試條件為：10%流穿,，重組 人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rh-aFGF），6 min 停留時(shí)間,；c 10 cm 柱高下的最大測(cè)試流 速,。

3 、使用方法參考

3.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí),，填料的色譜柱裝填方法,。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理,。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積,，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積,。Heparin NUPharoseFF的壓縮比為~1.15,，Heparin NUPharose HP的壓縮比為~1.20。為使達(dá)到裝柱比,，可通過(guò)柱頭下壓的方法,，也可以通過(guò)高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積,，抽濾除去液體,，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次,，以除去保存液,。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液,，制成 50~75 v%的裝柱填料懸液,，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液,，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水,，擰緊下堵頭,，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器）,，為避免引入氣泡,，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后,， 用裝柱液將裝柱器加滿,，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降）,，待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器，裝上上柱頭,，并將柱頭下降至界面處,；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa）,，繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵,，打開(kāi)柱頭上的閥門/堵頭,，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置,，旋緊柱頭,，裝柱完成。裝柱完成后,，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料,。

3.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量,。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱因子（As）來(lái)評(píng)價(jià),。

3.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

在上樣前，可用初始緩沖液A在操作流速下平衡層析柱,，觀察檢測(cè)器的變化,，直到電導(dǎo)、pH等參數(shù)不變,。本產(chǎn)品的緩沖液體系可為磷酸鹽,、檸檬酸鹽和Tris-HCl等，濃度為10~20 mM ,，pH為7~8為宜,。

樣品通常溶于上述緩沖液A，或者將樣品溶液進(jìn)行換液處理,，置換成緩沖液A體系,。上樣量可按“mg 目標(biāo)蛋白/mL填料"來(lái)設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%,，例如Heparin NUPharoseFF產(chǎn)品對(duì)rh-aFGF的DBC10%為~10mg/mL,，純化時(shí)的上樣量可為5~8mg/mL。除了DBC10%,，也可以測(cè)試上樣流穿液中的目標(biāo)蛋白確定上樣量,。

3.4  洗雜（wash）

在緩沖液A中添加一定量的鹽對(duì)上樣后的色譜柱進(jìn)行沖洗可以抑制非特異性吸附，從而提高產(chǎn)物純度。200~600mM的NaCl是常用的提高離子強(qiáng)度的鹽,，具體的離子強(qiáng)度可以通過(guò)線性梯度或者階躍梯度確定,。洗雜的體積通常為3~10個(gè)柱體積。

3.5  洗脫（Elution）

洗脫過(guò)程則可以進(jìn)一步提高緩沖液A中的鹽濃度,，添加1.5~2 M的NaCl可將目的蛋白有效洗脫,。

3.6  再生與在位清洗（CIP）

通常可用5 CV的洗脫液將填料再生,。若有失活蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)在再生時(shí)洗不掉,可用在位清洗（CIP）除去,。可采用以下選擇進(jìn)行在位清洗：0.1mol/L NaOH,、非離子型表面活性劑等,。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì)，反向效果更佳,。具體的CIP溶液選擇可參考下表,。

3.7  填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，含50mM醋酸鈉,，使用過(guò)后可繼續(xù)用相同的保存液,。保存溫度在2~30 ℃為宜，不可凍存,。