藍(lán)膠-瓊脂糖

1 ,、產(chǎn)品介紹

Blue NUPharoseFF 是一種染料親和填料,，通常稱為藍(lán)膠，Blue NUPharose FF的配基為三嗪類活性染料,，特殊的結(jié)構(gòu)決定了其與蛋白結(jié)合的復(fù)雜性,，一般認(rèn)為其通過靜電相互作用、疏水相互作用以及氫鍵等作用力與蛋白結(jié)合,，適用于脫氫酶,、激酶、血漿類蛋白等的分離純化,。

2 ,、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測試條件為：10%流穿，4 min 停留時間,；c 10 cm 柱高下的最大測試流速,。

3 、染料親和層析原理

 Blue NUPharose FF 配基的特殊結(jié)構(gòu)決定了其對蛋白質(zhì)的吸附是一個復(fù)雜的過程,。除對蛋白質(zhì)分子上的二核苷酸鏈具有親和作用外,，其蒽醌雜環(huán)與蛋白質(zhì)分子非極性面之間存在疏水作用，芳香環(huán)上的磺酸基又使其具有離子交換基團(tuán)的性質(zhì),，可能導(dǎo)致蛋白與配基之間存在非均一結(jié)合,。

因此對于不同的蛋白及配基和蛋白之間的結(jié)合情況也不盡相同。以BSA為例,，pH值的變化對其在Blue NUPharose FF上的吸附影響非常顯著,。隨著pH值的升高，吸附容量急劇下降,。主要原因是隨著pH值的升高,，蛋白質(zhì)分子上帶有正電荷的區(qū)域?qū)p小，導(dǎo)致與染料之間的靜電相互作用減弱,，所以吸附量降低,。當(dāng)pH值在5.5~8.0降低時，蛋白質(zhì)吸附容量的提高主要是由蛋白質(zhì)分子中組-氨酸殘基引起的,。而BSA分子中具有較高水平的組-氨酸殘基含量(17個組-氨酸殘基/581殘基),，所以吸附量隨PH值的變化比較顯著。

4 ,、使用方法參考

4.1 色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時,，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,，液體最好做脫氣處理,。

（2）填料用量計(jì)算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）,。沉降體積是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定 體積,。Blue NUPharoseFF的壓縮比為 1.15,。為使達(dá)到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法,，也可以通過高流速壓柱,。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體,，并用約3倍填料體積的純化水洗滌,，重復(fù)3次，以除去保存液,。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液,，使用前攪勻,。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣,，在柱內(nèi)保留少量的裝柱液,，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面,。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器）,，為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下,。將所有填料加入后,，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接,。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器,，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處,；通過高流速（推薦流速見下表,，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標(biāo)記界面穩(wěn)定時的柱高,。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭,，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭,，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置，旋緊柱頭,，裝柱完成,。裝柱完成后,，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測定和評價

完成裝柱后,、使用前可通過柱效測定和評價可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量,。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價.

4.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

結(jié)合緩沖液常見的磷酸鹽、醋酸鹽等均可作為結(jié)合緩沖液,，需根據(jù)樣品特點(diǎn)選擇合適的結(jié)合緩沖液（記為緩沖液A）,。根據(jù)第3章節(jié)的染料親和層析原理，適當(dāng)?shù)偷?/span>pH的結(jié)合緩沖液能促進(jìn)蛋白的結(jié)合,，一般情況下pH范圍在5.5~8.0之間宜,。

實(shí)際使用過程中，上樣料液的體積往往較大,，在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱,，該過程通常需要5~10個柱體積的緩沖液A,，以電導(dǎo)、pH 等檢測信號參數(shù)不變且與緩沖液A對應(yīng)為準(zhǔn),。

上樣量可按“mg 目標(biāo)蛋白/mL填料"來設(shè)定,，通常為DBC10%的50~80%，例如 Blue NUPharose FF產(chǎn)品對BSA的DBC10%為~20mg/mL,，純化時上樣量可為10~16mg/mL,。 除了DBC10%，也可以測試上樣流穿液中的目標(biāo)蛋白確定上樣量,。上樣前需要對樣品進(jìn)行離心（10000 g以上）,、過濾（0.22或0.45 μm）處理，以免堵塞色譜柱,，樣品的pH需與上樣緩沖液保持一致,。

上樣后需要3~10個柱體積的緩沖液 A 再平衡層析柱。

4.4  洗脫（Regeneration）

染料親和的樣品多種多樣,，親和原理較為復(fù)雜,，相應(yīng)的洗脫方式也需隨樣品不同而改變。通?？梢愿淖兙彌_液的pH,、離子強(qiáng)度（例如添加2 M NaCl）和極性（例如添加50%乙二醇）。純化酶時可加入低濃度的輔因子進(jìn)行競爭洗脫,。

4.5  再生（Regeneration）

可以采用高pH（0.1MTris,，0.5 M NaCl，pH 8.5）和低pH（0.1MNaAc,，0.5M NaCl,，pH 4.5）交替清洗4~5次去除結(jié)合較強(qiáng)的蛋白質(zhì)使層析柱再生,。

4.6  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過程可將填料徹-底清洗。若發(fā)生柱壓升高,，或?yàn)榱吮苊饨徊嫖廴?，將金屬離子剝離后可進(jìn)行在位清洗過程?？刹捎靡韵氯軇┻M(jìn)行在位清洗：2mol/L NaCl,，1mol/L NaOH、70%乙醇或30%異丙醇等,。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì),，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱體積的純水除去上述溶劑,。

4.7 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇,，0.1mol/L KH2PO4，pH 8.0,。使用過后可繼續(xù)相同的溶液保存,。保存溫度在2~8 ℃為宜，不可凍存,。