普施安紅-瓊脂糖

1 ,、產(chǎn)品介紹

Red NUPharoseFF是活性紅120（又稱普施安紅HE-3B）活性染料鍵合在NUPharose瓊脂糖微球上得到的親和填料,。活性紅120是多環(huán)染料,，與NADP+具有結(jié)構(gòu)類(lèi)似性,，可用于純化核苷酸依賴性酶、脂蛋白,、乳酸脫氫酶,、纖溶酶原、肽,、激素等的純化,。除了作為親和填料使用，本產(chǎn)品配基含芳香環(huán)和陰離子,，也通過(guò)靜電作用或者疏水相互作用進(jìn)行非親和純化,。

2 ,、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測(cè)試條件為：10%流穿,，,；c 10 cm 柱高下的最 大測(cè)試流速。

3 、使用方法參考

 3.1 色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí),，填料的色譜柱裝填方法,。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,，液體最好做脫氣處理,。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）,。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積,。Red NUPharose FF的壓縮比為1.15。為使達(dá)到裝柱比,，可通過(guò)柱頭下壓的方法,，也可以通過(guò)高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積,，抽濾除去液體,，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次,，以除去保存液,。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液,，制成 50~75 v%的裝柱填料懸液,，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液,，以除去下墊片及層析柱下端的空氣,，在柱內(nèi)保留少量的裝柱液，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面,。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器）,，為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下,。將所有填料加入后,，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接,。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降）,，待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器，裝上上柱頭,，并將柱頭下降至界面處,；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa）,，繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵,，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭,，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置,，旋緊柱頭,，裝柱完成。裝柱完成后,，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料,。

3.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量,。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱因子（As）來(lái)評(píng)價(jià),。

3.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱,，該過(guò)程通常需要5~10個(gè)柱體積的緩沖液A,，以電導(dǎo)、pH等檢測(cè)信號(hào)參數(shù)不變且與緩沖液A對(duì)應(yīng)為準(zhǔn),?？梢赃x擇磷 酸鹽、Tris-HCl等常見(jiàn)的緩沖體系,。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL填料"來(lái)設(shè)定,，通常為DBC10%的50~80%，例如Red NUPharoseFF產(chǎn)品對(duì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量為~15mg/mL，純化時(shí)的上樣量可為7.5~12mg/mL,。除了DBC10%,，也可以測(cè)試上樣流穿液中的目標(biāo)蛋白確定上樣量。上樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行離心（10000 g以上）,、過(guò)濾（0.22或0.45μm）處理,，以免堵塞色譜柱。

上樣后需要3~10個(gè)柱體積的緩沖液A 再平衡層析柱,。

3.5 洗脫（Elution）

通常在緩沖液A中添加3 M NaCl或者2 M KCl可將目標(biāo)蛋白洗脫,。

3.6  再生（Regeneration）

純化后可用弱酸和弱堿性緩沖液交替沖洗色譜柱3~4 次，進(jìn)行填料再生,，例如0.1mol/L NaAc+0.5mol/L NaCl（pH4.5）和0.1mol/L Tris·HCl+0.5mol/L NaCl（pH8.5）,。然后用平衡緩沖溶液平衡。

3.7 在位清洗（CIP）

通常上述的洗脫和再生過(guò)程可將填料徹-底清洗,。若發(fā)生柱壓升高,，或?yàn)榱吮苊饨徊嫖廴荆刹捎靡韵氯軇┻M(jìn)行在位清洗：0.1~0.5 mol/L NaOH,、70%乙醇或30%異丙醇等,。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì)，反向效果更佳,。清洗后需用3~5 柱體積的純水除去上述溶劑,。

3.8  填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過(guò)后可繼續(xù)用20%乙醇并添加0.5M NaCl保存,。保存溫度在2~30 ℃為宜,，不可凍存。