瓊脂糖微球-重組耐堿蛋白A親和填料

1 、產(chǎn)品介紹

 NuPerley rat-PA是一款抗體親和填料,，其配基rat-PA為重組耐堿蛋白A（Recombinant Alkali-tolerant Protein A,，rat-PA），NuPerley基球是新一代高剛性瓊脂糖微球,。

重組耐堿蛋白A配基由大腸桿菌表達(dá),，不含動(dòng)物來源，該配基通過多點(diǎn)偶聯(lián)的方式與基球偶聯(lián),，減少了配基掉落,，通常情況下相對于抗體的配基掉落量可控制在5~10ppm以內(nèi)。加之基因工程改造,，其對人IgG的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量穩(wěn)定在45mg/mL,，可耐受0.1~0.5M濃度的NaOH溶液清洗和去除熱源。相較于ProANUPharoseFF,，本產(chǎn)品保持了對人,、小鼠、大鼠,、兔,、牛等等來源的多種類型和亞型的抗體有親和作用，可從腹水,、血清,、細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞抽提物中分離和純化多種哺乳動(dòng)物不同亞型的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白，可滿足不同規(guī)模的研究或生產(chǎn)嚴(yán)格的清潔要求,。

2 ,、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測試條件為：10%流穿,，6 min 停留時(shí)間；c 推 薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下 2~6 min 停留時(shí)間的使用條件,，并非只能在該流速范圍 內(nèi)工作,；d 10 cm 柱高下的最大測試流速。

3 ,、使用方法參考

 3.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí),，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,，液體最好做脫氣處理,。

（2）填料用量計(jì)算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）,。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積,。NuPerley rat-PA的壓縮比為1.10。為使達(dá)到裝柱比,，可通過柱頭下壓的方法,，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積,，抽濾除去液體,，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次,，以除去保存液,。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液,，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻,。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液,，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水,，擰緊下堵頭,，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器）,，為避免引入氣泡,，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下,。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿,，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降）,，待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器，裝上上柱頭,，并將柱頭下降至界面處,；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa）,，繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵,，打開柱頭上的閥門/堵頭,，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置,，旋緊柱頭,，裝柱完成。裝柱完成后,，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料,。

3.2  柱效測定和評價(jià)

完成裝柱后,、使用前可通過柱效測定和評價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jià),。柱效測定可以采用丙酮或者NaCl作為樣品進(jìn)行,，按照下表配制樣品溶液和流動(dòng)相。

根據(jù) UV 或者電導(dǎo)率曲線計(jì)算理論塔板高度（HETP）,、理論塔板數(shù)（N）和非對稱因子（As）,，公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L為柱高；VR為保留體積,；Wh為半高峰寬,；a為在10%峰高處的第一個(gè)半峰寬；b為在10%峰高處的第二個(gè)半峰寬,。

一般來說,，HETP的數(shù)值應(yīng)小于填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3，D50為填 料的平均粒徑），As應(yīng)在0.8~1.5之間,。

3.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB緩沖液（20mM PB+150 mM NaCl,，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液,，記為緩沖液 A,。

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱,，該過程通常需要5~10個(gè)柱體 積的緩沖液A,，以電導(dǎo)、pH等檢測信號參數(shù)不變且與緩沖液A對應(yīng)為準(zhǔn),。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL 填料"來設(shè)定,，通常為DBC10%的50~80%，例如NuPerley rat-PA產(chǎn)品對人IgG的DBC10%為~45 mg/mL,，上樣量可控制為23~36 mg/mL,。在條件篩選階段，也可以降低上樣品,，觀察結(jié)合,、特異性和洗脫情況。上樣前需要對樣品進(jìn)行離心（10000 g以上）,、過濾（0.22或0.45μm）處理,，以免堵塞色譜柱。

上樣后需要3~10個(gè)柱體積的緩沖液A再平衡層析柱,。

3.4  洗脫與再生（Elution & Regeneration）

最-常用的洗脫方式為pH=3~4的甘-氨酸,、檸檬酸鹽或乙酸鹽，該條件可基本將抗體完-全洗脫,。但該pH較低,，可能會(huì)使一些抗體失活或聚集，在條件篩選階段可逐步降低pH,，篩選出收率可接受,、抗體不失活或不聚焦的最高pH，通常在pH=4.5~6時(shí),，抗體開始被洗脫,。也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩沖液中，中和至中性,，以縮短低pH條件的接觸時(shí)間,。洗脫之后，可用5~10個(gè)柱體積的洗脫液對色譜柱進(jìn)行再生,。

3.5  在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱壓升高，或有蛋白與填料強(qiáng)烈結(jié)合無法洗脫，或有沉淀,、變性蛋白時(shí),，需要對填料進(jìn)行在位清洗，可采用以下用0.1~0.5 M 濃度的NaOH去除雜質(zhì),，反向清洗效果更佳,。

3.6  填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇,，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~8℃為宜,，不可凍存,。