三羧甲基乙二胺-瓊脂糖

1 ,、產(chǎn)品介紹

NRPB58——Ni-TED NUPharose FF Ni-TED NUPharose FF是金屬離子脫落率最-低的一款金屬螯合親和填料，配基為三羧甲基乙二胺（tris-carboxymethyl ethylene diamine,，TED）基團(tuán),，配位金屬離子為Ni2+，

本產(chǎn)品的TED配基與Ni2+形成的五配位結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好,，對(duì)螯合劑,、還原劑、酸,、堿等試劑有著出色的耐受性,，可在10mM EDTA、100 mM β-ME或50 mM DTT等條件下正常使用,，可在pH=1或pH=14的條件下處理24h后保持出色的色譜性能,，也長期保存在10mM NaOH 中，洗脫液中需要的咪唑濃度相對(duì)其他金屬螯合填料更低。因此,，Ni-TED NUPharose FF適合用于下列純化體系：

l 目標(biāo)蛋白中含半胱-氨酸或者對(duì)氧敏感,，需要添加 β-ME 或 DTT 時(shí)；

l 目標(biāo)蛋白中含半胱-氨酸且有金屬反應(yīng)性,，需要添加 DTT 和 EDTA 時(shí)

l 目標(biāo)蛋白容易被金屬蛋白酶水解,，需要添加 EDTA 時(shí)；

l 目標(biāo)蛋白對(duì)高濃度咪唑敏感,，需要降低洗脫液中咪唑濃度時(shí),；

l 真核細(xì)胞表達(dá)體系中本身含 β-ME 或 EDTA 的情況；

l 對(duì)產(chǎn)物中金屬離子含量要求嚴(yán)格時(shí),。

Ni-TED NUPharoseFF的配基偶聯(lián)工藝經(jīng)過了特殊的設(shè)計(jì),，使得成品的壓力/流速特性得到大幅提升，最大流速和耐壓分別超過1500cm/h和0.5MPa,。通過配基修飾過程的優(yōu)化,，本產(chǎn)品在親和力（載量）和特異性（選擇性）之間取得良好的均衡：對(duì)帶組-氨酸標(biāo)簽蛋白的結(jié)合量大于20 mg/mL的同時(shí)，一步純化后樣品純度可達(dá)90%以上,。

2 ,、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo) 

a 三羧甲基乙二胺（TED）基團(tuán)與基球之間有十個(gè)原子長度的間隔臂,，為親和填料提 供更加高效的捕獲效果。

b90%體積以上的微球在此粒徑范圍,。

c 10%穿透下的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（DBC10%），測(cè)試的樣品為大腸桿菌表達(dá)帶組-氨酸標(biāo)簽的重組蛋白,，6 min 停留時(shí)間,。

d  并非指只能在該流速范圍內(nèi)工作,。需結(jié)合柱高確定適宜的工作流速，通常情況下上樣的停留時(shí)間2~6 min 范圍內(nèi)可保持出色的親和捕獲能力和純化效率,。CIP 過程的流速則一般不超過 150 cm/h,。

e 10 cm 柱高下的最大測(cè)試流速及該最大流速下的壓力。

3,、金屬螯合親和層析

金屬離子親和層析是基于蛋白質(zhì)分子表面的組-氨酸的咪唑基,、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與Ni2+、Co2+,、Cu2+,、Zn2+等形成配位結(jié)合而進(jìn)行生物大分子分離純化的過程。其中,，以Ni2+為螯合離子來純化帶6個(gè)以上組-氨酸組成的標(biāo)簽蛋白最為常見,，本說明書也以該體系為例簡要闡述Ni-TED NUPharose FF的親和原理（圖1）。

NUPharose基球修飾上TED配基后,，該配體擁有五個(gè)配位基團(tuán),，其中兩個(gè)氮原子和三個(gè)氧原子與Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位數(shù)的八面體結(jié)構(gòu),，剩余的一個(gè)自由配位點(diǎn)可以與溶劑分子或蛋白質(zhì)分子結(jié)合,。Ni2+與組-氨酸標(biāo)簽蛋白的咪唑基團(tuán)配位結(jié)合的過程即為金屬螯合填料與目標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合過程。提高緩沖液中咪唑的濃度可以將目標(biāo)蛋白洗脫,，洗脫過程中咪唑和目標(biāo)蛋白競爭與Ni2+的結(jié)合,。

金屬離子親和層析過程的非特異性吸附可能會(huì)來自離子相互作用、金屬離子與含組-氨酸,、半胱-氨酸,、色-氨酸蛋白之間的相互作用。前者可通過提高緩沖液的離子強(qiáng)度得到抑制,，通常添加500mM的NaCl,；后者可在上樣緩沖液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在沖洗過程中添加咪唑而除去。經(jīng)過優(yōu)化,，可以得到樣品純度和收率均較高的結(jié)果,。

Ni-TED NUPharose FF填料在使用過程中Ni2+掉落量極少，可連續(xù)使用多次,。

4 ,、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí)，填料的色譜柱裝填方法,。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）,。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積,。Ni-TED NUPharose FF的壓縮比為1.15。為使達(dá)到壓縮比,，可通過柱頭下壓的方法,，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積,，抽去液體,，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次,，以除去保存液,。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液,，制成 50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體積分?jǐn)?shù)為67%）,，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液,，以除去下墊片及層析柱下端的空氣,，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭,，調(diào)整柱子使其垂直于地面,。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器）， 為避免引入氣泡,，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下,。將所有填料加入后， 用裝柱液將裝柱 器加滿,，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降）,，待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器，裝上上柱頭,，并將柱頭下降至界面處,；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa）,，繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定,，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵,，打開柱頭上的閥門/堵頭,，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭,，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置，旋緊柱頭,，裝柱完成,。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料,。

4.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量,。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱因子（As）來評(píng)價(jià),。

4.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

金屬螯合填料與磷酸鹽、Tris-HCl等緩沖體系兼容,，其中20mM PB+500mM NaCl（pH=7.4）的體系最為常用,。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液A,。緩沖液A的特點(diǎn)為不含或者含少量咪唑,，pH在7~8之間居多，呈弱堿性,。實(shí)際使用過程中,，如果上樣料液的體積特別大，從降低成本的角度考慮,，可不往料液中添加咪唑和NaCl來抑制非特異性吸附,，而是在上樣后進(jìn)行沖洗來去除雜質(zhì)。

在上樣前,，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱,，該過程通常需要5~10個(gè)柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo),、pH等檢測(cè)信號(hào)參數(shù)不變且與緩沖液A對(duì)應(yīng)為準(zhǔn),。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL填料"來設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%,，上樣后需要3~10個(gè)柱體積的緩沖液A 再平衡層析柱,。

4.4  洗雜（Wash）

在緩沖液A中添加5~40mM的咪唑沖洗層析柱，可以將非特異性結(jié)合的雜蛋白除去,。咪唑濃度越高,，雜蛋白被除去得越徹-底，但會(huì)降低目標(biāo)蛋白的收率,。洗雜過程咪唑的濃度與不同蛋白的特性相關(guān),，可通過階躍洗雜過程（例如5mM、10mM,、20 mM……）快速優(yōu)化洗雜條件,。洗雜的體積通常為3~10個(gè)柱體積,。

4.5  洗脫（Elution）

最-常用的洗脫方式為提高洗脫液中咪唑的濃度（在緩沖液A中加入咪唑），推薦在0~500mM范圍內(nèi)進(jìn)行階躍洗脫或者線性梯度洗脫,，確定最-優(yōu)的洗脫濃度,。對(duì)于大多數(shù)帶組-氨酸標(biāo)簽的蛋白，50~150 mM的咪唑濃度可以將目標(biāo)蛋白洗脫完-全,。

4.6  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過程可將填料徹-底清洗,。若發(fā)生柱壓升高，或?yàn)榱吮苊饨徊嫖廴?，將金屬離子剝離后可進(jìn)行在位清洗過程,。可采用以下溶劑進(jìn)行在位清洗：2mol/L NaCl ,，1mol/L NaOH,、70%乙醇或 30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì),，反向效果更佳,。清洗后需用3~5 柱體積的純水除去上述溶劑。

4.7 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇,，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存,。保存溫度在2~30 ℃為宜，不可凍存,。