易洗脫鏈霉親和素-瓊脂糖

1 ,、產(chǎn)品介紹

ee-SANUPharoseFF是將基因工程改造的鏈霉親和素（Streptavidin ,，SA）和瓊脂糖凝膠偶聯(lián)而成的親和層析分離介質(zhì)。ee意為易洗脫（easy elution）,，即可以溫和洗脫結(jié)合在介質(zhì)上的生-物素化物質(zhì),，如生-物素化抗原、生-物素化抗體,、生-物素化蛋白,、生-物素化核酸等，可用于Avi-Tag融合表達(dá)的生-物素化蛋白的純化,、經(jīng)過(guò)標(biāo)記反應(yīng)后的生-物素化和非生-物素化物質(zhì)的分離,、生-物素化抗原抗體固定化和重復(fù)回收利用等。

Streptavidin NUPharoseFF,，由于鏈霉親和素與生-物素的超-強(qiáng)親和力,，溫和常用的方法不能將生-物素標(biāo)記物質(zhì)洗脫。ee-SA配基經(jīng)過(guò)分子層面的設(shè)計(jì)改造,，大幅降低了與生-物素的親和力,，同時(shí)保持了與生-物素的特異性。結(jié)合在ee-SANUPharose FF填料上的生-物素化物質(zhì)可通過(guò)含D-生-物素的緩沖液競(jìng)爭(zhēng)洗脫,，該洗脫方式溫和,，一般不會(huì)影響目標(biāo)物的活性，洗脫液中的D-生-物素可通過(guò)換液方式去除,。因而通過(guò)ee-SANUPharoseFF的一步層析就可獲得有活性,、高純度的生-物素化物質(zhì)。

2 ,、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測(cè)試條件為：D-生-物素標(biāo)記 BSA ，10%流穿,，6 min 停留時(shí)間,；c 10 cm 柱高下的最大測(cè)試流速。

3 ,、易洗脫鏈霉親和素填料應(yīng)用原理簡(jiǎn)介

鏈霉親和素與D-生-物素之間的親和力非常高,，其解離常數(shù)在10?14 mol/L 數(shù)量級(jí)，是自然界最-強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一,。因而常規(guī)的Streptavidin NUPharose FF填料與生-物素標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合后,，需要在變性條件下洗脫,。在該使用方式下，樣品易失活,，填料的性能也受影響,。

ee-SANUPharoseFF填料上的ee-SA配基經(jīng)過(guò)基因工程改造后，保持了與生-物素的 特異性的同時(shí),，削弱了親和力,，因而可通過(guò) D-生-物素競(jìng)爭(zhēng)洗脫（圖 1），擴(kuò)展了鏈霉親 和素填料的應(yīng)用范圍,。圖 2 為 ee-SANUPharoseFF 純化生-物素化物質(zhì)的過(guò)程,，包含特異 性結(jié)合、D-生-物素競(jìng)爭(zhēng)洗脫,、NaOH 再生等環(huán)節(jié),。

4 、使用方法參考

 4.1 色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí),，填料的色譜柱裝填方法,。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理,。

填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積,，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱(chēng)壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定 體積,。ee-SANUPharoseFF的壓縮比為1.15,。為使達(dá)到裝柱比，可通過(guò)柱頭下壓的方法,，也可以通過(guò)高流速壓柱,。

填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體,，并用約3倍填料體積的純化水洗滌,，重復(fù)3次，以除去保存液,。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液,，使用前攪勻,。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣,，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水,，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器）,，為避免引入氣泡,，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后,，用裝柱液將裝柱器加滿(mǎn),，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接,。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降）,，待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器,，裝上上柱頭,，并將柱頭下降至界面處；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表,，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa）,，繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高,。停泵,，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭,，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置,，旋緊柱頭，裝柱完成,。裝柱完成后,，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后,、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量,。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱(chēng)因子（As）來(lái)評(píng)價(jià)。

4.3  平衡與上樣

（1）緩沖液選擇：一般選用pH6~8的結(jié)合緩沖液,，常用緩沖液有10~100mM磷 酸鈉緩沖液,、20~200mM Tris-HCl緩沖液等，根據(jù)樣品的穩(wěn)定性,，也可添加其他成分，如NaCl,、還原劑,、螯合劑等。若不確定最合適的緩沖體系,，在初次使用ee-SANUPharose FF時(shí),，推薦使用20mM PBS（20 mM NaH2PO4，0.15 M NaCl，調(diào)節(jié)pH 7.4）或20 mM Tris-HCl,，0.15M NaCl,，pH8.0作為結(jié)合緩沖液。

（2）樣品處理：樣品的緩沖液應(yīng)與所選結(jié)合緩沖液一致,。為保證緩沖液一致,，可以在結(jié)合緩沖液中破碎細(xì)菌、或調(diào)解pH 與結(jié)合緩沖液一致,、或交換至結(jié)合緩沖液（常用方法有透析,、超濾、脫鹽柱換液等）,、或用結(jié)合緩沖液稀釋2~10倍等,。樣品上柱前應(yīng)0.45μm過(guò)濾。

（3）平衡：用結(jié)合緩沖液平衡5個(gè)柱體積,，建議流速為~150 cm/h

（4）上樣流速：推薦線(xiàn)性流速20~100 cm/h,。較小的流速有利于載量的提高，可根據(jù)實(shí)際結(jié)合情況選擇流速,，能獲得較好的效果,。

（5）再平衡：上樣后用結(jié)合緩沖液再平衡5~10個(gè)柱體積，或平衡至基線(xiàn),，洗去雜質(zhì),，推薦流速為~150 cm/h。

4.3 洗脫

結(jié)合了生-物素化物質(zhì)的ee-SANUPharoseFF可采用溫和的方式洗脫,，一般在結(jié)合緩沖液中加入1-10 mM的D-生-物素作為洗脫緩沖液,，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)的方法洗脫。

4.4 再生

（1）填料使用后需要再生,，本產(chǎn)品耐受一定的堿性,，推薦使用2~5個(gè)柱體積的 20-100 mM NaOH 溶液反向清洗柱子，進(jìn)行再生,，推薦流速為~150 cm/h,。

（2）其他方法，比如 1-2M NaCl ,、70%乙醇,、30%異丙醇等，也可用于該介質(zhì)的再生,。

4.5 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇,，使用過(guò)后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~8℃為宜,，不可凍存,。