重組金黃色-葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠基球FF

1 、產品介紹

 ProANUPharoseFF 是一款抗體親和填料,，其配基 rProtein A 為重組金黃色-葡萄球菌蛋白A,，基球 NUPharose 是經典的瓊脂糖凝膠基球，FF 為 Fast Flow 的縮寫,，意味該填料可在高流速下工作,。重組金黃色-葡萄球菌蛋白A 配基由大腸桿菌表達，不含動物來源,，保留了野生型的 5 個結合域,，因而 ProANUPharose FF 的載量遠高于野生型蛋白A 填料，對人 IgG 的動 態(tài)結合載量高于 40 mg/mL ,。ProANUPharoseFF 對人,、小鼠、大鼠,、兔,、牛等等來源的 多種類型和亞型的抗體有親和作用，可從腹水,、血清,、細胞培養(yǎng)上清或細胞抽提物中分 離和純化多種哺乳動物不同亞型的抗體或包含抗體 Fc 片段的基因工程重組蛋白，可滿足不同規(guī)模的研究或生產需求,。

2 ,、產品特點與技術指標

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍,；bDBC10%測試條件為：10%流穿,，6 min 停留時間；c 推 薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下 2~6 min 停留時間的使用條件,，并非只能在該流速范圍內工作,；d 10 cm 柱高下的最大測試流速。

3,、抗體親和層析簡介——重組金黃色-葡萄球菌蛋白 A

 ProA NUPharose FF 的配基保留了野生型重組金黃色-葡萄球菌蛋白 A 的 E ,、D 、A,、 B ,、C 五個 IgG 結合域。每個結構域有 58 個氨基酸殘基,，以反平行的三個 α 螺旋排列,， 所有結構域都能與 IgG1、IgG2 和 IgG4 的 Fc 區(qū)結合,，與 IgG3 的親和力則非常弱,。蛋白 A 與 IgG 之間的特異性結合源自非共價相互作用，包括在 IgG 生理條件的溶液狀態(tài)下的 疏水相互作用,、極性相互作用和氫鍵,。蛋白A 主要與 IgG 的 Fc 區(qū)結合，不過也有研究 證據表明 D 結合域可以與 Fab 區(qū)結合,。一般需要降低 pH 將親和作用破壞后進行洗脫,， 例如 pH=3 的甘-氨酸、檸檬酸鹽和乙酸鹽等,。

除了金黃色-葡萄球菌蛋白 A,，重組鏈球菌蛋白 G 也可以與 IgG 結合。下表為蛋

白A 和蛋白G 對不同哺乳動物不同亞型抗體的結合情況,。注：-表示不結合,；+表示微弱結合；++表示中等結合,；+++表示很強結合,。

4 ,、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法,。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積,，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮 比（也稱壓縮因子）,。沉降體積是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定 體積。ProANUPharoseFF 的壓縮比為 1.15,。為使達到裝柱比,，可通過柱頭下壓的方法， 也可以通過高流速壓柱,。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應體積，抽濾除去液體,，并用約 3 倍 填料體積的純化水洗滌,，重復 3 次，以除去保存液,。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成 50~75 v%的裝柱填料懸液,，使用前攪勻,。

（5）裝填前準備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣,，在柱內保留少量的蒸餾水,，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直于地面,。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內（必要時使用裝柱器）,， 為避免引入氣泡，應使之沿層析柱內壁自然流下,。將所有填料加入后,， 用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋,，將柱子與層析系統(tǒng)連接,。

（7）壓柱：使柱內填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完-全后（填料與液體的界面清晰）,，去除裝柱器,，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處,； 通過高流速（推薦流速見下表,，注意柱壓不超過 0.3 MPa）,，繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定， 標記界面穩(wěn)定時的柱高,。停泵,， 打開柱頭上的閥門/堵頭，關閉柱底的閥門/堵頭,，下壓柱 頭至標記位置下方與壓縮比對應的位置,，旋緊柱頭，裝柱完成,。裝柱完成后,，需用高流 速平衡柱內的填料。

4.2  柱效測定和評價

完成裝柱后,、使用前可通過柱效測定和評價可以確認層析柱裝填質量,。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。柱效測定可以采用丙酮或者 NaCl 作為樣品進行,，按照下表配制樣品溶液和流動相,。

根據 UV 或者電導率曲線計算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數(shù)（N）和非對稱 因子（As）,，公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2

As=a/b

其中：L 為柱高,；VR 為保留體積；Wh 為半高峰寬,；a 為在 10%峰高處的第一個半峰寬,； b 為在 10%峰高處的第二個半峰寬。

一般來說,，HETP 的數(shù)值應小于填料平均粒徑的三倍（即 HETP/D50<3 ,，D50 為填 料的平均粒徑），As 應在 0.8~1.5 之間,。

4.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB 緩沖液（20 mM PB+150 mM NaCl,，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系。 初始的緩沖液稱為平衡緩沖液,，記為緩沖液 A,。

在上樣前，需用緩沖液 A 在操作流速下平衡層析柱,，該過程通常需要 5~10 個柱體 積的緩沖液 A,，以電導、pH 等檢測信號參數(shù)不變且與緩沖液 A 對應為準,。

上樣量可按“mg  目標蛋白/mL 填料"來設定,，通常為 DBC10% 的 50~80%，例如 ProA NUPharose FF 產品對人 IgG 的 DBC10%為~40 mg/mL,，上樣量可控制為 20~32 mg/mL ,。 在條件篩選階段,，也可以降低上樣品，觀察結合,、特異性和洗脫情況,。上樣前需要對樣 品進行離心（10000 g 以上）、過濾（0.22 或 0.45 μm）處理,，以免堵塞色譜柱,。

上樣后需要 3~10 個柱體積的緩沖液 A 再平衡層析柱。

4.5  在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱壓升高,，或有蛋白與填料強烈結合無法洗脫,，或有沉淀、變性蛋白時,，需 要對填料進行在位清洗,，可采用以下方法去除雜質，反向清洗效果更佳,。

4.6  填料保存

填料的初始保存液為 20%乙醇,，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存,。保存溫度在 2~8℃ 為宜，不可凍存,。