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所 在 地上海市
更新時間:2024-10-06 10:05:18瀏覽次數(shù):1122次
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小鼠白介素2受體(IL-2R)ELISA Kit 標本的采取和保存
可用作ELISA測定的標本十分廣泛,,體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液,、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份,。有些標本可直接進行測定(如血清、尿液),,有些則需經(jīng)預處理(如糞便和某些分泌物),。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,,其他成份均同等于血清,。制備血漿標本需借助于抗凝劑,而血清標本只要待血清自然凝固,、血收縮后即可取得,。除特殊情況外,,在醫(yī)學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用,。血清標本可按常規(guī)方法采集,,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),,以HRP為標記的ELISA測定中,,溶血標本可能會增加非特異性顯色。
血清標本宜在新鮮時檢測,。如有細菌污染,,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,也會產(chǎn)生假陽性反應,。如在冰箱中保存過久,,其中的可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深,。一般說來,,在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃,超過一周測定的需低溫冰存,。凍結血清融解后,,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,,應充分混勻宜輕緩,,避免氣泡,可上下顛倒混和,,不要在混勻器上強烈振蕩,。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾,,澄清后再檢測,。反復凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測,,宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應注意無菌操作,也可加入適當防腐劑,。
小鼠白介素2受體(IL-2R)ELISA Kit 試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,,應為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用,。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存,。
加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚,,即加標本,加酶結合物,,加底物,。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,,并注意不可濺出,,不可產(chǎn)生氣泡。 加標本一般用微量加樣器,,按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標本應更換吸嘴,以免發(fā)生交叉污染,,也可用一次性的定量塑料管加樣,。有此測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液,,再在其中加入血清標本,然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和,。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器,,使加液過程迅速完成。
保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,,即加標本和加酶結合物后,。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間,,這一保溫過程稱為溫育(incubation),有人稱之為孵育,,在ELISA中似不恰當,。ELISA屬固相免疫測定,抗原,、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例,加入板孔中的標本,,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會,,只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,,因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點,。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育,。溫育常采用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,,也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應動力學研究時,實驗表明,,兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時,,產(chǎn)物的生成可達。為加速反應,,可提高反應的溫度,,有些試驗在43℃進行,但不宜采用更高的溫度,??乖贵w反應4℃更為*,在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過一夜,,以形成zui多的沉淀,。但因所需時間太長,在ELISA中一般不予采用,。保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,,一般均采用水浴,可將ELISA板置于水浴箱中,,ELISA板底應貼著水面,,使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),,板上應加蓋,,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,此時可讓反應板漂浮在水面上,。若用保溫箱,,ELISA板應放在濕盒內(nèi),濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,,在盒底墊濕的紗布,,zui后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度,,特別是在氣溫較低的時候更應如此,。無論是水浴還是濕盒溫育,反應板均不宜疊放,,以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應,操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi),,標準室溫溫度是指20-25℃,,但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育,。室溫溫育時,ELISA板只要平置于操作臺上即可,。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確,。為保證這一點,一個人操作時,,一次不宜多于兩塊板同時測定,。
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