免疫熒光實驗代測,，免疫熒光代測,，免疫熒光找上海信帆生物

上海信帆生物代做免疫熒光實驗。老師提供樣本即可,，我司可以進行蠟塊切片可提供抗體等,。免疫熒光檢測我們分單標和雙標。

一,、服務介紹

免疫熒光細胞化學是根據(jù)抗原抗體反應的原理,，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）,。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色）,，可以看見熒光所在的細胞或組織,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,，以及利用定量技術測定含量,。

二、實驗原理

將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上,，與其相應的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應,。

三,、實驗流程

免疫熒光單標記方法

免疫熒光單標記是指只標記一種蛋白質(zhì)分子，方法比較簡單,，只要按照染色步驟去做,，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇,，固定液選擇的合適與否,，可能會直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下,。

1,、所需材料與試劑

a, 培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達到60%-70%的細胞。

b, 一抗,、FITC或TRITC標記的二抗,。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預冷20 min),。

d, 封閉液。

e, 0.01mol／LPBS緩沖液,。

2,、染色方法

a, 取出培養(yǎng)有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2-3遍,。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min,。

d，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min,，抑制IgG的非特異性結(jié)合,。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

e, 去掉正常血清,，直接加入一抗,，37℃孵育1 h或4℃過夜?？贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗而定),。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min,，0.3% TritonX 5 min,，0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗,，37℃,，孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain,，0.01 mol/LPBS洗5min,，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min,，用濾紙吸干,。

i, 90%甘油(PBS配制)封片。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察,，或于4℃避光保存,。

免疫熒光雙標記方法

免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子，當懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明,。此方法稍微復雜一些,，首先應注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔,；B抗體為單克隆抗體,，來自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應重疊,，且盡量遠離,，通常可以選擇FITC和TRITC,、Alex488和TRITC,、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合,。通常情況下,，染色時兩種一抗可以同時孵育，然后可以同時孵育兩種二抗,。但當染色結(jié)果一種顏色非常弱,，而另一種顏色比較強時，應考慮先孵育顏色較弱的二抗,。其他步驟同免疫熒光單標記,。

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實驗操作注意事項：

1,、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h,，時間過長,，可能會使熒光提前衰退。

2,、每次試驗均需設置以下三種對照：

(1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記物;

(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物;

(3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物,。

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