ELISA實驗代測之：如何控制好ELISA實驗操作過程

操作過程的控制：

⑴ 嚴格按照試劑說明書進行操作,。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min,。

⑵ 加樣后及時放人孵箱。標本較多時,，要分批操作,。按說明步驟嚴格控制操作時間,，防止孵育時間人為延長,，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*,。

(3)封板溫育時,，各孔一定要封嚴,，防止陽性標本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn),。

(4)用洗板機洗板時,，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通,，洗完板后在吸水紙(選擇干凈,、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn),。

(5)合理安排檢測量,，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。

(6)加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干,。

(7)顯色劑盡量在臨用前配制,，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用,。

(8)加樣時保持顯色劑不外流;A,、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,。

(9)應(yīng)保證C清潔,，整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至zui低限度,。從而提高檢測的特異性,。并得到更準確,、可靠的實驗結(jié)果,。

加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性，直接影響檢測結(jié)果,。由于吸嘴構(gòu)造特殊,，導(dǎo)致清洗困難，加大了交叉污染的機會,。建議用一次性吸嘴,。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準,。加樣時應(yīng)將所加物加在 ELISA 板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,。

溫浴影響,，在建立 ELISA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明,，兩次抗原 抗體 反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時,，產(chǎn)物的生成可達。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確,。由于公司的 試劑 盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板,。另外溫育中還有邊緣效應(yīng),，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果,，將質(zhì)控放在非邊緣位置,。96孔酶標板結(jié)構(gòu)特別;易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴格要求,，酶標板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同,，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異;干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴,，并要求固相板放入水中,，減少受熱不均，貼密封膜,，防止污物浸入,。

洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著實驗的成敗,。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的,。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA 操作中,，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視,，操作者應(yīng)嚴格按要求洗滌,，不得馬虎。

洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,，各種 試劑 盒的洗液不要混用,。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團,，也含親水基團,，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用,，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,，其濃度可在0.05%-0.2%之間,，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度,。洗液需要稀釋,，應(yīng)按要求稀釋。配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的純化水,，電導(dǎo)率小于1.5μs/cm,，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。手洗條件一致性較差,，對結(jié)果影響較大,，防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。半自動與全自動冼板機使用不當也會影響結(jié)果,，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài),，造成未結(jié)合標記酶洗脫不*，導(dǎo)致“花板”造成假陽性或假陰性;所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nèi)洗液的通暢狀況,，及時糾正,，洗板機不用時應(yīng)用去離子水清冼幾遍。

保證洗板浸泡時間為 40 秒左右,，孔內(nèi)液體被洗板機吸得越干凈洗滌效果更好,，手工洗板！

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