上海信帆生物提供 PCR實驗代測，實時熒光定量PCR實驗代測,，RT-PCR代測,。客戶只需要提供樣本,，其他所有試劑都由本公司提供,。一般7-10天出結果,，提供原始數(shù)據(jù),，分析數(shù)據(jù)，實驗報告,，實驗室所用儀器型號,，圖片，動力擴增曲線等,。代測費用現(xiàn)在6.2折*,，！ 
 
Real -Time PCR,，即實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行解析的方法,，它是在PCR反應體系中加入熒光物質，并通過Real -Time PCR檢測系統(tǒng)對PCR反應進程中的熒光信號強度進行實時監(jiān)測,，zui終對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理的方法,。Real -Time PCR自1996年由美國Applied Biosystems公司推出以來，廣泛應用于生物研究的各個領域,。目前主要有SYBR Green 染料,、Taqman探針法兩種。
 
PCR實驗代測,，熒光定量PCR代測服主要儀器及耗材
旋渦振蕩器 ：上海青浦瀘西儀器廠產(chǎn)品
手握式電動勻漿機：德國FLUKO 公司產(chǎn)品
低溫冷凍離心機：Sigma（3K15）公司產(chǎn)品
Real-time檢測儀：ABI （ABI-7300）公司產(chǎn)品
超純水分離系統(tǒng)：美國LABCONCO公司
離心管及10μL,、200μL、1000μL槍頭等常規(guī)耗材均為國產(chǎn),；RNA提取過程中所需的離心管,、槍頭等耗材經(jīng)過0.1%的DEPC水浸泡過一夜，121℃滅菌30min,，烘干后備用,。
 
PCR實驗代測，熒光定量PCR代測服實驗室試劑的操作
1)所用的所有溶液都應該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染,。
2)所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的-新鮮蒸餾的去離子水,，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌,。
3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑,，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。
4)所用試劑都應該以大體積配制,，實驗一下看試劑是否滿意,，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存,。
5)所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
6)新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗,。
7)樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應該小心保存,。 

本程序適用于自動PCR操作，可適用于大多數(shù)情況,，所用酶是不含核酸外切酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶,，如Taq聚合酶等。  
引物（各50pmol）  0.2mmol/L dNTPs（必須使用高質量的dNTPs,，這一點非常重要,。dNTPs經(jīng)反復化凍后會發(fā)生降解，因此應分成小份保存,。應注意混合物中四種dNTP的量要相等）  模板DNA：約0.05～1mg基因組DNA或0.002～0.02mg質粒DNA  Taq  DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）  10×PCR緩沖液（500mmol/L KCl,，15mmol /L MgCl ₂ ，100mmol/L  Tris ·HCl,，pH 8.3）  礦物油  
電泳所需試劑  
【儀器設備】  
PCR擴增儀  
電泳裝置  
微量離心機  
微量移液器（1～20ml和20～200ml）  
0.5ml Eppendorf 管  
紫外線觀察裝置及照相設備 

 操作程序 

1．在無菌的Eppendorf管內加入以下反應物：

2．93℃ 反應2 min后開始以下循環(huán)： 
93℃變性反應1 min,； 
50℃退火反應1 min； 
72℃延伸反應3 min,。 
經(jīng)過17～35循環(huán)后,，zui后一個循環(huán)72℃增加5 min。循環(huán)結束后反應產(chǎn)物置于40℃保存,。 
3．取1～5ml反應產(chǎn)物走凝膠電泳,，經(jīng)溴化乙錠染色檢測擴增的情況。 
 
應注意的問題及其解決方法 

1．PCR反應條件的優(yōu)化 
要優(yōu)化特定的PCR反應,，有必要試用不同的反應組分和循環(huán)參數(shù),。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對反應結果的影響，從中大家可以得到一些線索以改進反應條件,，提高PCR產(chǎn)量和/或特異性,，一般情況下，只須改變一兩個參數(shù)就行了,，如pH值和MgCl₂濃度,。表2-2給出了循環(huán)參數(shù)對PCR結果的影響。 
表2-1 PCR各反應組分濃度對產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的影響

* 效果可能不可預測
** 添加10% DMSO時,，Taq DNA聚合酶的活性會被抑制47%,，因此反應加大Taq DNA聚合酶的用量（即5U）予以補償
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改變以提高PCR產(chǎn)物的特異性和/或產(chǎn)量的循環(huán)參數(shù)

* 使用基因組DNA作模板時，開始幾個循環(huán)變性應于97℃進行 
** 假定Tm值為60℃ 
*** 延伸時間依產(chǎn)物大小而定：1000bp的產(chǎn)物延伸30s即可,，產(chǎn)物更長時,，按每1000 bp延伸0.5 min計，在后期循環(huán)中增加延伸時間可以提高擴增效率
2．引物的設計 
毫無疑問，引物的堿基組成,，長度及其靶序列的同源性是決定PCR成敗的首要因素,，選擇設計引物在一定程度上仍然要靠經(jīng)驗，對于某一對引物而言尚無通用的規(guī)則可嚴,，但應遵守以下原則： 
（1）一般性原則： 
①長度：15～30bp,，其有效長度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38，否則PCR的zui適延伸溫度會超過Taq酶的*作用溫度（74℃）,，從而降低產(chǎn)物的特異性,。 
②G＋C含量：應在45%～55%之間，PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5～10度,。引物長度小于20時,，其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。 
③ 堿基分布的隨機性：應避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基,。尤其是不應在其3’端出現(xiàn)3個的連續(xù)的G或C，否則會使引物在G＋C富集序列區(qū)錯誤引發(fā),。 
④ 引物自身：不能含有自身互補序列,，否則會形成發(fā)夾樣二級結構。 
⑤引物之間：兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基,，不然會形成引物二聚體,，尤應避免3’端的互補重疊。 
⑥特異性：與非特異擴增序列的同源性應小于70%,，或少于連續(xù)8個的互補堿基,。 
（2）引物的3’端： 
引物的3’端很大程度上影響Taq酶的延伸效應，除特殊情況（AS-PCR）外,，3’端不應發(fā)生錯配,。S. Kwok等發(fā)現(xiàn)，引物的3’端發(fā)生錯配時,，A:A使產(chǎn)量下降至1/20,，A:G或C:C下降至1/100。當末位堿基是T時,，即使錯配也能引發(fā)鏈的合成,，而為A時錯配的引發(fā)效率zui低，G,、C居間,。 
因此，引物的3’端堿基選用A,、G,、C，而盡可能地避免選用T，尤應避免連續(xù)出現(xiàn)2個以上的T,。 
此外,，如果擴增編碼區(qū)域，引物的3’端不要終止于密碼子的第3位,，因此處易發(fā)生簡并,，從而影響擴增特異性。 
（3）避開引物的二級結構區(qū)： 
某些引物無效的原因是引物重復區(qū)二級結構的影響,，因此選擇擴增片段時應注意避開二級結構區(qū),，有些計算機軟件可幫助確定該區(qū)域，如不能避開,，則可用7- deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP,，有助于PCR成功。 
目前在引物選擇中已廣泛應用計算機軟件,，從EMBL或Genebank中查找有關基因序列,，并依據(jù)上述原則對所選用引物進行評價。 
3．出現(xiàn)異常結果時的解決思路 
在做PCR反應的過程中,，由于其酶促反應的本質,，影響zui終結果的因素較多，所以出現(xiàn)一些非預料的結果是可以理解的,。下面簡單地總結一下在PCR反應結果出現(xiàn)異常時我們應該采取的措施,。 
（1）電泳檢查沒有 PCR產(chǎn)物 
a．需檢查一下Taq DNA聚合酶是否失活，或是活性太低,，還需查一下在加樣過程中是否向體系中加過Taq DNA聚合酶,； 
b．需檢查一下所使用的引物，看其序列設計是否正確,，是否堿基組成不平衡,； 
c．需要檢查一下PCR反應過程中模板是否變性充分，尤其在前幾個循環(huán)中是否變性充分,；可以適當?shù)靥岣吣０遄冃缘臏囟然蚴沁m當延長變性的時間,；  
d．需檢查一下在PCR反應體系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制劑，如SDS污染等等,； 
e．需檢查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染,，可以預先加熱使之失活。 
（2）電泳檢查出現(xiàn)引物二聚體區(qū)帶 
a．需檢查一下兩個引物的3’端是否互補,，或者是否有相類似的回文結構,； 
b．需檢查一下使用的引物是否太短，可以予以適當?shù)难娱L,； 
c．需檢查模板的用量,，模板以10－4個拷貝為*,，模板太少會造成引物相對過量； 
d．適當?shù)亟档鸵锏臐舛?，引物濃度過高是出現(xiàn)引物二聚體的zui主要原因,；  
e．循環(huán)次數(shù)太多也易形成引物二聚體，可以適當?shù)販p少循環(huán)數(shù),；  
f．可以將復性溫度提高一些以減少引物二聚體形成,。  
（3）電泳檢測PCR產(chǎn)物呈片狀（smear）  
a．需檢查一下Taq DNA聚合酶的用量，適當?shù)販p少Taq酶的量有助于特異性條帶擴增,；  
b．可以提高反應的退火溫度,，或者直接采用兩個溫度的PCR（68℃退火和延伸，94℃模板變性）,；  
c．適當?shù)亟档蚆g ²⁺ 的濃度也可起到降低非特異性擴增可能性的作用,；  
d．適當?shù)販p少反應退火的時間和延伸的時間；  
e．適當?shù)販p少循環(huán)次數(shù)也會有效果,；  
f．可以嘗試使用巢式引物PCR（nested primer PCR）,。  
（4）電泳檢測PCR產(chǎn)物出現(xiàn)其它非特異性條帶  
a．需檢查一下引物的3’端是否有連續(xù)排列的G或C；  
b．可以適當?shù)靥岣咄嘶饻囟然蛑苯硬捎脙刹綔囟萈CR方法進行擴增,；  
c．可以降低Taq DNA聚合酶的用量,，同時也降低引物的濃度；  
d．可以適當?shù)販p少退火所用的時間以及延伸反應的時間,；  
e．可以適當?shù)卦黾踊驕p少一些Mg ²⁺ 濃度。  
4．假陽性  
實驗中設立的陰性對照可提示有無假陽性結果出現(xiàn),。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現(xiàn)一個或幾個陽性結果,，提示本次實驗中其它標本的檢測結果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品污染,、擴增試劑污染,、擴增產(chǎn)物交叉污染等。常見的污染來源包括實驗室環(huán)境,、加樣器,、操作中形成的噴霧、DNA抽提儀器,、試劑及任何與擴增產(chǎn)物接觸的東西,。  
預防各種污染的措施主要有：（1）工作區(qū)隔離。（2）改進實驗操作,，如在加樣過程中避免試劑飛濺,、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等,。（3）操作程序合理化,，如后加陽性對照等,。  
交叉污染的處理方法包括：（1）在DNA模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應管內容物以破壞污染的PCR產(chǎn)物,。一般選用波長254nm照射30min（Nature, 1990, 34:27）,。（2）PCR實驗中使用dUTP，而不用dTTP,。在擴增前使用UraciⅠN-glycosylase（尿嘧啶糖基化酶）處理可降解交叉污染的PCR產(chǎn)物,，而不降解基因組DNA模板，然后熱滅活此酶,，再進行擴增反應（Gene, 1990, 93: 125）,。美國PE公司提供此類試劑盒（PCR carry-over preventionkit）。（3）在PCR反應前加入一種光化學試劑,，反應完成后激活該試劑,，光化學試劑可交聯(lián) DNA鏈，使之不能再擴增（Nucleic Acids Res, 1991, 19: 99）,。  
2.2.2.5 PCR技術在分子生藥學中的應用  
對于生藥學家來說,，PCR技術已稱為他們研究生藥的一種嶄新而有力的工具。PCR技術在生藥學中的應用主要有兩方面：①擴增和直接測序或者對屬性特異的DNA序列定性以用于系統(tǒng)發(fā)育或親緣關系的分析,，也可用于鑒定品種,；②通過簡單純化從復雜生物樣品的混合物中鑒定病原體和土壤微生物，用于藥用植物的基因工程,。 

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