上海信帆生物科技有限公司是一家以海外留學(xué)回國(guó)專家為技術(shù)力量的生物科技型公司，公司專注于研究和生物試劑人ELISA試劑盒,，大鼠ELISA試劑盒和小鼠ELISA試劑盒。公司采用ISO9001的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，采用進(jìn)口高品質(zhì)的材料,，利用*生物試劑技術(shù)，為廣大科研客戶提供高品質(zhì)的ELISA試劑盒產(chǎn)品,。

接下來(lái)給大家普及一下ELISA試劑盒的基礎(chǔ)知識(shí):

一,、酶免疫技術(shù)的分類

　　酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種,。免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的檢測(cè)方法,，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑,，以檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。它的特點(diǎn)是具有高度的特異性和敏感性,。如將抗原或抗體用可以微量檢測(cè)的標(biāo)記物（例如放射性核素,、熒光素、酶等）進(jìn)行標(biāo)記,，則在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后,，可以不必測(cè)定抗原抗體復(fù)合物本身，而測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物,，通過(guò)標(biāo)記物的放大作用,，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。這種標(biāo)記免疫技術(shù)一般分為兩類,，一類用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原或抗體的定位,；另一類用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的測(cè)定。前者屬于免疫組化技術(shù)范疇,，后者則稱為免疫測(cè)定,。

　　酶免疫測(cè)定根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的與游離的酶標(biāo)記物而分為均相和異相兩種類型，實(shí)際上所有的標(biāo)記免疫測(cè)定均可分成這兩類,。以標(biāo)記抗體檢測(cè)標(biāo)本中的抗原為例,，按照簡(jiǎn)單的形式是在試劑抗體過(guò)量的情況下進(jìn)行，其反應(yīng)式如下：

Ab*+ Ag——Ab*Ag+Ab*

　　Ab*Ag代表結(jié)合的標(biāo)記物,， Ab*為游離的標(biāo)記物,。如在抗原反應(yīng)后，先把Ab*Ag與Ab* 分離,；然后測(cè)定Ab*Ag或Ab*中的標(biāo)記物的量,，從而推算出標(biāo)本中的抗原量，這種方法稱為異相法,。如在抗原抗體反應(yīng)后Ab*Ag中的標(biāo)記物* 失去其特性,，例如酶失去其活力，熒光物質(zhì)不顯熒光,，則不需要進(jìn)行Ab*Ag 與Ab*的分離,，可以直接測(cè)定游離的Ab* 量，從而推算出標(biāo)本中的Ag含量,，這種方法稱為均相法。

　　在異相法中,，抗原和抗體如在液體中反應(yīng),，分離游離和結(jié)合的標(biāo)記物的方法有許多種。與放射免疫測(cè)定相類似的液相異相酶免疫技測(cè)定,，在某些激素等定量測(cè)定中也有應(yīng)用,。但常用的酶免疫測(cè)定法為固相酶免疫測(cè)定,。其特點(diǎn)是將抗原或抗體制成固相制劑，這樣在與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)后,，只需經(jīng)過(guò)固相的洗滌,，就可以達(dá)到抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)的分離，大大簡(jiǎn)化了操作步驟,。這種被稱為EL1SA 的檢測(cè)技術(shù)成為目前研究檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣的免疫測(cè)定方法,。

二、方法類型和操作步驟

　　ELISA可用于測(cè)定抗原,，也可用于測(cè)定抗體,。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：① 固相的抗原或抗體，② 酶標(biāo)記的抗原或抗體,，③ 酶作用的底物,，根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法,。

　?。ㄒ唬╇p抗體夾心法：

　　雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法，操作步驟如下：

　?。?）將特異性抗體與固相載體連接,，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

　?。?）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,，讓標(biāo)本中的抗原與同相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物,。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),。

　　（3）加酶標(biāo)抗體：使同相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

　?。?）加底物：酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理,，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,，即可雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。

　?。ǘ╇p位點(diǎn)一步法：

　　在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí),，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步,。這種雙位點(diǎn)一步法不但簡(jiǎn)化了操作,，縮短了反應(yīng)時(shí)間,，如果使用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高,。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平,。

　　在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng),，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后滯現(xiàn)象,。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,，而不再形成夾心復(fù)合物,，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。

　?。ㄈ╅g接法測(cè)抗體 ：

　　間接法是檢測(cè)抗體時(shí)zui常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗-抗體檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體,。故稱為間接法,。操作步驟如下：

　　（1）將特異性抗原與固相載體連接,，形成固相抗原,。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

　?。?）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合,，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體,。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去,。

　?。?）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶,。洗滌后,，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如： 欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體,，可用酶標(biāo)羊抗人lgG抗體,。

　　（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量,。本法只要更換不同的固相抗原,，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。

　?。ㄋ模└?jìng)爭(zhēng)法：

　　競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原,，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例,，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與同相抗體結(jié)合,，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

　?。?）將特異抗體與固相載體連接,，形成固相抗體，洗滌,。

　?。?）待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng),。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原,，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原,，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合,，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少,。參考管中只加酶標(biāo)抗原,，保溫后，酶標(biāo)抗原與同相抗體的結(jié)合可達(dá)zui充分的量,。洗滌,。

　　（3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原zui多,，故顏色zui深,，參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量,。待測(cè)管顏色越淡,，表于標(biāo)本中抗原含量越多。

　?。ㄎ澹┎东@法測(cè)lgM抗體

　　血清中針對(duì)某些抗原的特異性lgM常和特異性lgG伺時(shí)存在,，后者會(huì)干擾lgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定lgM抗體多用捕獲法,。先將所有血清lgM（包括異性lgM和非特異性lgM）固定在固相上,，在除去lgG后再測(cè)定特異性lgM。

　　操作步驟如下：

　?。?）將抗人lgM抗體連接在固相載體上,，形成固相抗人lgM。

　?。?）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的lgM 抗體被固相抗體捕獲,。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

　?。?）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性lgM 結(jié)合,。

　　（4）加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體,，使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合,。

　　（5）加底物顯色：如有顏色顯示,，則表示血清標(biāo)本中的特異性lgM抗體存在,，為陽(yáng)性反應(yīng)。

　?。┯H和素和生物素的ELlSA親和素是一種糖蛋白,，可由蛋清中提取。分子量60kD,，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成,，可以和4 個(gè)生物素分子親密結(jié)合。現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）,。生物素（biotin）又稱維生素H,，分子量244.31，存在于蛋黃中,。用化學(xué)方法制成的衍生物,，生物素一羥基玻璃亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì),、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物,。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng),，但特異性強(qiáng),，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定,。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置,，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體,。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來(lái),，就可大大提高檢測(cè)的靈敏度。

　　親和素——生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式,，可用于間接包被,，亦可用于終反應(yīng)放大。可以在同相上先預(yù)包被親和素,，原用吸附法包被固相的抗體或抗原生物素結(jié)合,，通過(guò)親和素——生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原固相化，這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量,，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露,。另外，在常規(guī)ISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代,，然后連接親和素——酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào),。