液體樣本甘油含量測定試劑盒

描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物,。脂蛋白酯酶能夠水解血液中的甘油三酯,；胰脂酶可以水解食物中的甘油三酯,；激素敏感脂肪分解酶能夠水解脂肪細(xì)胞中的甘油三酯,。與游離脂肪酸一樣,，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測指標(biāo),，但檢測更加方便。本試劑盒采用甘油磷酸氧化酶法與經(jīng)典的GPO-Trinder 酶學(xué)反應(yīng)方法,，通過比色測定液體樣本中的甘油含量,。經(jīng)過優(yōu)化后，操作步驟更加簡單,，檢測線性范圍在10-1200µmol/L,，可靠性和重復(fù)性俱佳,，適合生物醫(yī)學(xué)、食品實(shí)驗(yàn)室檢測,。

原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3- 磷酸甘油,，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化

氫；在過氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺,，其光密度值與甘油濃度成正比,。

 適用范圍：測定血液，細(xì)胞培養(yǎng)基,、體液,、酒類飲料中的甘油濃度。

 組成： (105 次微板測定或 30 次 1 ml 比色杯測定)：

(1) R1 試劑 40 ml

(2) R2 試劑 10 ml

(3) 4 mmol/L 甘油標(biāo)準(zhǔn)品 1 ml ,，4 ℃,，儲存6 月。

操作步驟：

一 樣本處理：

1.       酒類,、飲品,、清澈液體樣本：可直接進(jìn)行測定，如超過線性范圍可用蒸餾水或生理鹽水稀釋后再進(jìn)行測定,。

2.       培養(yǎng)液：取不含酚紅,、無顏色、無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基,，如有細(xì)胞碎片應(yīng)4ºC,,，12,000g離心5min,取上清進(jìn)行測定。

3.       血液：對于新鮮抗凝血而言,，可4ºC,，2,000g離心5min得到血漿；而對于非抗凝血來說,，可先4ºC靜置2h得到血清后,，2000g離心10min,除去血細(xì)胞。將得到的血漿/血清70ºC 加熱10分鐘滅活內(nèi)源脂肪酶,，12,000g離心10min ,去上清進(jìn)行測定或-20ºC保存,。

二 工作溶液配制：按4:1比例，取4 ml試劑R1與1 ml試劑R2混合即可,，立即使用或4ºC保存<1天,，變色棄去。

 三 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水,、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體,，將4 mM甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000、500,、250,、125、62.5,、31.25,、15.625、7.8125 µmol/L,，通常取其中4~6管即可,，注意設(shè)置0濃度對照反應(yīng)管。

四 甘油濃度測定：

1.       加樣,。為使反應(yīng)時(shí)間盡量一致,，減小實(shí)驗(yàn)誤差，可先加入標(biāo)準(zhǔn)品,、待測樣品,，然后再加入工作溶液。（注意：當(dāng)甘油濃度較低時(shí),，可將待測樣品與工作溶液按照100µl:100µl體積進(jìn)行混合,，然后再進(jìn)行測定，但是如果樣品體積超過100µl時(shí)將會稀釋工作液中酶的濃度,，致使反應(yīng)靈敏度下降,。如果待測樣品濃度超過線性范圍的時(shí)候，可進(jìn)行適當(dāng)稀釋,，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)來計(jì)算樣品中甘油濃度,。）

2.       37ºC或25ºC反應(yīng) 15分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在60分鐘內(nèi)穩(wěn)定,。

3.       先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零,，然后測定各管OD值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度,。附Excel作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸,，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù),，點(diǎn)擊做圖向?qū)?，選擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-,。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn),，點(diǎn)擊-添加趨勢線-，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-,，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R²值-,。