體液外泌體(Exosome)提取試劑(包括乳汁,、唾液,、尿液等）

適用范圍：

1、可用于后續(xù)電鏡觀察,、NanoSight納米粒度分析,，加入細胞共培養(yǎng)，Western blot,、ELISA,、蛋白質(zhì)組學(xué)分析，小RNA提取和qPCR,。

2,、只需少量樣品、孵育和臺式離心,，外泌體回收率穩(wěn)定,、結(jié)構(gòu)完整純度高。

3,、媲美SBI公司ExoQuick和Invitrogen的Total Exosome Isolation外泌體分離試劑盒,，是國內(nèi)性加比zui高的外泌體提取試劑盒

描述：細胞內(nèi)存在許多膜性囊泡(vesicle)結(jié)構(gòu),，可以分泌排到胞外--即外泌體(exosome),，也稱為microvesicle或microparticle--它們均可稱為extracellular vesicle。外泌體直徑約30~150 nm,，攜帶多種核酸,，蛋白酶、MHC,、骨架蛋白,、熱休克蛋白、miRNA和脂質(zhì)信號分子,。外泌體分泌到細胞外基質(zhì)后,，可jing血液,、尿液、腦脊液,、唾液,、乳汁、淋巴等體液運送到相鄰或遠隔的組織細胞并被其攝取,，因而在同類或不同類型的細胞間的物質(zhì)和信息遠程交換中起重要作用,。外泌體調(diào)節(jié)許多細胞功能，如免疫調(diào)控,、腫瘤新生和轉(zhuǎn)移,，或為疾病早期診斷標志物，也可作為藥物載體,。

外泌體分離純化的經(jīng)典方法是超速離心或密度梯度離心法,，但需要超速離心機和大量樣品、操作繁瑣耗時,，回收率和純度不穩(wěn)定,。外泌體制備試劑盒能替代超速離心法，適應(yīng)少至100µl 的樣品,，只需孵育和臺式離心,，即可制備出高純度外泌體，用于后續(xù)蛋白,、RNA檢測試驗,。

操作步驟

1.       樣品預(yù)處理：3000× g離心15分鐘去除細胞和碎片，上清轉(zhuǎn)移到新管用于提取外泌體,。如需制備更高純度的外泌體,，可用0.22µm濾膜過濾離心上清一次。

2.       每1體積的樣品,，加入0.2體積的外泌體純化試劑,。例如1ml樣品加0.2ml外泌體純化試劑，5ml樣品加1ml外泌體純化試劑,，充分混勻,。

3.       4 ºC孵育12小時，無需搖動,。注意：血清血漿富含蛋白,，孵育可縮短至1個小時。

4.       1500× g離心15分鐘收集外泌體沉淀,，棄上清,。常溫或4 ºC離心不影響結(jié)果。

5.       1500× g再次離心5分鐘，小心吸除殘余液體,，勿觸動外泌體沉淀,。

6.       加100µl PBS重懸外泌體沉淀。若初始樣品及外泌體沉淀多可多加PBS重懸,。后續(xù)若進行Western blot可直接加50-100 µl RIPA Lysis Buffer裂解外泌體,。如提取RNA可在PBS重懸外泌體后，采用RNAtrip LS 液體樣品RNA提取試劑R1020提取外泌體RNA,。

說明：通常1 ml細胞培養(yǎng)上清分離的外泌體能滿足一次Western blot實驗,。外泌體常見標志蛋白CD63, CD9, CD81, Tetraspani, HSP70，可用RIPA Lysis Buffer,、全套Western blot試劑,、Super ECL Plus超敏發(fā)光液檢測。RNAtrip LS液體樣品RNA提取試劑可純化外泌體小RNA,。 

若提取外泌體用于蛋白分析,，對于外泌體含量高的樣品：血清、血漿,、腹水,、唾液、乳汁,，可采用500µL (或100-500µL)的初始樣品量,，再加入等體積的預(yù)冷PBS緩沖液稀釋混勻，然后根據(jù)稀釋后的終體積,，再加入0.2體積的外泌體提取試劑,。對于外泌體含量較低的樣品：組織塊培養(yǎng)上清、細胞培養(yǎng)上清,、尿液,、腦脊液，可采用1 ml樣品體積,，不用PBS稀釋,，處理后直接加入提取試劑。若提取的外泌體用于小RNA和qPCR分析,，建議采用較大體積的樣品,，例如5-10ml。

采用EDTA而非肝素抗凝血,，以免影響后續(xù)PCR,。