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明膠酶譜法檢測試劑盒說明書

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MMP-2&MMP-9明膠酶譜法檢測試劑盒說明書

    MMP Zymography Assay KitXF-P17750  750T

   1. 簡介:

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白,,又稱膠原酶。通過影響細胞外基質(zhì),,膠原酶參與胚胎發(fā)育,、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程,,并參與炎癥,、腫瘤、心血管,、神經(jīng)等許多疾病過程,。血漿與組織中的MMP-2MMP-9參與各種生理與病理過程,,其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視,。

2. 檢測原理:

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2MMP-9 活性,。Zymography 是一種廣為使用的,、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,其靈敏度可達1 nM,,高于ELISA方法,,其基本原理1和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳,,電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育,,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,,形成深色背景,,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,,因而不被染色而形成透亮區(qū)域,,從而能同時指示MMP-2MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性,。本試劑盒提供MMP-2,、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2,、MMP-9 酶譜及活性,,檢測靈敏度~1nM,。試劑盒可進行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測,如果小膠加樣孔為10~15個,,則總計可檢測500~750個樣品,。

3. 檢測目的:

本試劑盒用于檢MMP-2MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM),。

4.  試劑盒組成與儲存:

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml , −20 ºC,;

B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋,;

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋,;

E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液, 4 ºC

      5.檢測步驟

      5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:推薦分離膠濃度為8%,。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠,。將10 × substrate G 融化,并90 ºC 加熱5分鐘,。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合,。

      5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣,。切勿加熱變性,,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液??赏ㄟ^預(yù)試驗確定加樣量,,使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。

陽性對照(可選步驟):可取人,、小鼠,、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣,。

注:因為全血成分復(fù)雜,MMP活性較低,,*方法是將全血中白蛋白進行分離做陽性對照

      5.3 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel,。溴酚藍跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳,。

      5.4 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,,放入容器內(nèi),。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),,室溫漂洗凝膠2 × 18 小時,,中間換液。如MMP 活性低,,Buffer A 孵育時間可延長至36-48小時,,中間24小時換液一次

      5.5 孵育:倒掉Buffer A,。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),,室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示,。如MMP 活性低,,應(yīng)延長孵育時間為10小時或過夜。

      5.6 顯色:倒掉Buffer B,,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液(操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書),。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域,。

透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2,、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2),、92 (MMP-9),、130 (proMMP-9)225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶,。

      5.7 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描,。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑,。解決辦法:可用非透射光掃描,,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設(shè)置為黑色,。MMP 條帶則為白色,,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中最常見的格式。

      6.說明

      1. 10 mM EDTA能夠*抑制MMP活性,。

      2. 凝膠干燥:可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠,,作為泳久錄保留。

     7.參考文獻:

     1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

      2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

  gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,,1980, 102,196–202

   SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書

      常規(guī)考馬斯亮藍SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實驗室常用的凝膠染色方法,。銀染方法雖然靈敏度高,但所需         試劑復(fù)雜并且有毒有害,,操作步驟繁瑣,,難以控制獲得好的染色效果。

     染色步驟:

1. 此染色液即為工作液,,使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝

膠,,并緩慢搖動2h,;

2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠,;

3. 以脫色液覆蓋凝膠,,緩慢搖動2h,傾去脫色液,,再加入新脫色液進行脫色,,直至獲得清晰的藍色的條帶和干凈的背景(通常此過程需要24h,也可脫色過夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景),;

4. 對凝膠進行分析和照相,,凝膠可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對

凝膠進行處理后保存,。

安全性:含有甲醇,,無特殊毒性,按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理,。

說明:

1. 染色液配方:0.25g 考馬斯亮藍R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,,定容至1000ml,混合1h 后用

Whatman 1 號濾紙過濾,,于室溫可無限期保存,;

2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88V:V:V);

3. 保存液:7%冰醋酸,;

4. 凝膠染色之后,,染色液可以回收利用,裝入新容器內(nèi),,室溫或4 ºC 保存,可反復(fù)使用2-4 次,。

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