人四氫生物蝶呤(BH4)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書

*部分  ELISA簡介

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。自上世紀70年代初問世以來,，發(fā)展十分迅速,，目前已被廣泛用 于生物學和醫(yī)學科學的許多領(lǐng)域。

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記,。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性,。在測定時,，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開,。再加入酶標記的抗原或抗體,，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例,。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析,。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,，使測定方法達到很高的敏感度,。

第二部分 ELISA 的樣本實驗準備

在收集樣本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定,。對收集后當天就進行檢測的樣本,，及時儲存在4℃?zhèn)溆谩τ诟籼煸贆z測的樣本,，及時分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?，有條件的，-70℃凍存?zhèn)溆?。標本?yīng)避免反復(fù)凍融,。

液體類標本: 包括血清、血漿,、尿液,、胸腹水,、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等,。

• 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心。
• 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA,、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心,。
• 尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。胸腹水,、腦脊液參照此實行,。
• 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。
• 培養(yǎng)細胞：檢測細胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
• 組織標本：切割標本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，或組織蛋白萃取試劑,，用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用,。
• 標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
• 不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

第三部分 ELISA試劑盒的檢測目的和實驗原理

1.檢測目的

本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中四氫生物蝶呤(BH4)含量,。

2.實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人四氫生物蝶呤(BH4)水平,。用純化 的人四氫生物蝶呤(BH4)抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中 依次加入四氫生物蝶呤(BH4),，再與 HRP 標記的四氫生物蝶呤(BH4)抗 體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色,。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的四氫生物蝶呤(BH4)呈正相關(guān),。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標 準曲線計算樣品中人四氫生物蝶呤(BH4)濃度,。

第四部分  試劑盒組成

第五部分 操作步驟

• 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀 釋。

• 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）,、標準孔、待測樣品孔,。在酶標包被板上標準品準確加樣 50µl,，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl， 然后再加待測樣品 10µl（樣品zui終稀釋度為 5 倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡 量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。
• 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘,。
• 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
• 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置 30 秒后棄去，如此

   重復(fù) 5 次,，拍干,。

• 加酶：每孔加入酶標試劑 50µl，空白孔除外,。
• 溫育：操作同 3,。
• 洗滌：操作同 5。
• 顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl,，再加入顯色劑 B50µl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

   15 分鐘.

• 終止：每孔加終止液 50µl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。
• 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）,。 測定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進行,。
• 操作程序總結(jié)：

第六部分  計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD  值為縱坐標,，在坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),， 即為樣品的實際濃度。

                                         （此圖僅供參考）

第七部分  注意事項

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未 用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差,。一次加樣時間 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔,。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值 大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定,，計 算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。

6．底物請避光保存,。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

第八部分 檢測范圍

  6ng/L -250 ng/L

第九部分 保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃,。

2．有效期：6 個月