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基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2/9)明膠酶譜法試劑盒說(shuō)明書(shū)
描述:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無(wú)活性的酶原形式分泌,,活化后能夠降解 細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱(chēng)膠原酶,。通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì),,膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生,、組 織重塑等過(guò)程,,并參與炎癥、腫瘤,、心血管,、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的 MMP-2,、MMP-9 參與各種生理與病理過(guò)程,,其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視 1。
本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測(cè) MMP-2,、MMP-9 活性,。Zymography 是一種廣為使用的、基 于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法,,其靈敏度可達(dá) 1 nM,,高于 ELISA 方法 2,其 基 本原理和程序是:制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠,,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電 泳, 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng) Buffer 孵育,,凝膠染色與脫色,。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染,形 成深色背景,,但在有蛋白酶條帶的位置,,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色 而形成透 亮區(qū)域,,從而能同時(shí)指示 MMP-2,、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性,。本試劑盒提供
MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,,可檢測(cè)少至 0.1~0.5 μl 血液中的 MMP-2,、MMP- 9 酶譜及活性,檢 測(cè)靈敏度~1 nM,。試劑盒可進(jìn)行 50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè),,如果小膠加樣孔為 10~15
個(gè),則總計(jì)可檢測(cè) 500~750 個(gè)樣品,。
適用: 檢測(cè) MMP-2,、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM)。 組成與儲(chǔ)存 (50 assays):
1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC,;
2.10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC,;
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋?zhuān)?BR>4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋?zhuān)?BR>5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(#P1501), 4 oC。
檢測(cè)步驟:
1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠:推薦分離膠濃度為 8%,。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠,。將 10 × substrate G 融化,并 90 oC 加熱 5 分鐘,。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍,,混勻后加入過(guò)硫酸銨和 TEMED,等待凝膠聚合,。
2. 待測(cè)樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),,混合后直接上樣。切勿加熱變性,,并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液,。可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,,使用普通蛋白預(yù)染 Marker 即可,。陽(yáng) 性對(duì)照(可選步驟):可取人、小鼠,、大鼠或兔 100μl 全血與 100μl 2 × SDS-PAGE non-
reducing buffer 等體積混合,,取 5-15μl 上樣。
3. 低電流恒流電泳,,每一塊小膠電流為 20 mA/gel,。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
4. 洗滌凝膠:取出凝膠,,去除濃縮膠,,放入容器內(nèi)??上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,,然后加入 10 ml
1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),,室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液,。
5. 孵育:倒掉 Buffer A,。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或 37oC 孵育 1~5 小時(shí),。陽(yáng)性 對(duì) 照或者血中的 MMP 通常 37oC 孵育 1 小時(shí)即可顯示,。如 MMP 活性低,應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為 10 小時(shí),。
6. 顯色:倒掉 Buffer B,,加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(操作步驟見(jiàn) SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū))。凝膠的大部分區(qū)域被深染,,在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域,。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性,。陽(yáng) 性對(duì)照將在 66~72 (MMP-2),、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9),、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透 明條帶,。
7. 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明,,但凝膠背景并非真正全黑,。解決 辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,,并盡量設(shè)置為黑 色,。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式,。
說(shuō)明
1. 10 mM 能夠 EDTA *抑制 MMP 活性,。
2. 凝膠干燥:可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠,作為*記錄保留,。
參考文獻(xiàn):
1.Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2.Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,,1980, 102, 196–202
SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū) P1501
常規(guī)考馬斯亮藍(lán) SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度 高,,但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害,,操作步驟繁瑣,難以控制獲得好的染色效果,。
染色步驟:
1. 此染色液即為工作液,使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝 膠,,并緩慢搖動(dòng) 2h,;
2. 傾去染色液,,用脫色液沖洗凝膠;
3. 以脫色液覆蓋凝膠,,緩慢搖動(dòng) 2h,,傾去脫色液,再加入新脫色液進(jìn)行脫色,,直至獲得清晰的 藍(lán)色的條帶和干凈的背景(通常此過(guò)程需要 2~4h,,也可脫色過(guò)一夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈 的背景);
4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相,,凝膠可放置在 7%的乙酸中保存,。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對(duì) 凝膠進(jìn)行處理后保存。
安全性:含有甲醇,,無(wú)特殊毒性,,按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。 說(shuō)明:
1. 染色液配方:0.25g 考馬斯亮藍(lán) R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,,定容至 1000ml,,混合 1h 后用 Whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾,于室溫可無(wú)限期保存,;
2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88(V:V:V),;
3. 保存液:7%冰醋酸;
4. 凝膠染色之后,,染色液可以回收利用,,裝入新容器內(nèi),室溫或 4 oC 保存,,可反復(fù)使用 2-4 次,。
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