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基質金屬蛋白酶（MMP2/9）明膠酶譜法試劑盒說明書

描述：基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,，活化后能夠降解 細胞外基質的膠原蛋白,，又稱膠原酶,。通過影響細胞外基質,，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生,、組 織重塑等過程,，并參與炎癥、腫瘤,、心血管,、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的 MMP-2,、MMP-9 參與各種生理與病理過程,，其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視   1。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2,、MMP-9  活性,。Zymography  是一種廣為使用的、基 于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,，其靈敏度可達 1 nM,，高于 ELISA 方法 2，其 基 本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠,，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電 泳,， 電泳結束后取出凝膠與酶反應 Buffer 孵育,，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染,，形 成深色背景,，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,，因而不被染色 而形成透 亮區(qū)域,，從而能同時指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性,。本試劑盒提供
MMP-2,、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液，可檢測少至 0.1~0.5 μl 血液中的 MMP-2,、MMP- 9 酶譜及活性,，檢 測靈敏度~1 nM。試劑盒可進行 50 次標準小膠檢測,，如果小膠加樣孔為 10~15
個,，則總計可檢測 500~750 個樣品。
適用: 檢測 MMP-2,、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM）,。 組成與儲存 (50 assays)：
1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；
2.10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC,；
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸餾水稀釋,；
4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸餾水稀釋；
5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(#P1501), 4 oC,。

檢測步驟：
1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為 8%,。按照標準程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化,，并 90 oC 加熱 5 分鐘,。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍，混勻后加入過硫酸銨和 TEMED,，等待凝膠聚合,。
2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣,。切勿加熱變性,，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^預試驗確定加樣量,，使用普通蛋白預染  Marker   即可。陽 性對照(可選步驟)：可取人、小鼠,、大鼠或兔 100μl 全血與 100μl 2 × SDS-PAGE non-
reducing buffer 等體積混合,，取 5-15μl 上樣。
3. 低電流恒流電泳,，每一塊小膠電流為 20    mA/gel,。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。
4. 洗滌凝膠：取出凝膠,，去除濃縮膠,，放入容器內?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,，然后加入  10    ml
1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘,。中間換液,。
5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),，室溫或 37oC 孵育 1~5 小時,。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37oC 孵育 1 小時即可顯示。如 MMP 活性低,，應延長孵育時間為 10 小時,。
6.  顯色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書）,。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域,。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2,、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2),、92 (MMP-9),、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透 明條帶,。
7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描,。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑,。解決 辦法：可用非透射光掃描,，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑 色,。MMP      條帶則為白色,，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

說明
1. 10 mM 能夠 EDTA *抑制 MMP 活性。
2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠,，作為*記錄保留,。

參考文獻：
1.Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2.Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202

SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書 P1501

常規(guī)考馬斯亮藍 SDS-PAGE 凝膠蛋白質染色是實驗室常用的凝膠染色方法,。銀染方法雖然靈敏度 高,，但所需試劑復雜并且有毒有害，操作步驟繁瑣,，難以控制獲得好的染色效果,。

染色步驟：
1. 此染色液即為工作液，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝 膠,，并緩慢搖動 2h,；
2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠,；
3. 以脫色液覆蓋凝膠,，緩慢搖動 2h，傾去脫色液,，再加入新脫色液進行脫色,，直至獲得清晰的 藍色的條帶和干凈的背景（通常此過程需要 2～4h，也可脫色過一夜至清晰的藍色的條帶和干凈 的背景）,；
4. 對凝膠進行分析和照相,，凝膠可放置在    7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對 凝膠進行處理后保存,。
安全性：含有甲醇,，無特殊毒性，按一般化學品操作規(guī)程處理,。 說明：
1. 染色液配方：0.25g 考馬斯亮藍 R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,，定容至 1000ml，混合 1h 后用 Whatman 1 號濾紙過濾,，于室溫可無限期保存,；
2. 脫色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；
3. 保存液：7％冰醋酸,；
4. 凝膠染色之后,，染色液可以回收利用，裝入新容器內,，室溫或 4 oC 保存,，可反復使用 2-4 次。