丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒

測定意義 PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成TPP,，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來,。

測定原理 PDH催化丙酮酸脫氫，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP）,，從而導(dǎo)致600nm光吸收的減少,。 需自備的儀器和用品 可見分光光度計、水浴鍋,、臺式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水。 試劑的組成和配制 試劑一：50mL×1瓶,，-20℃保存,； 試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存,； 試劑三：1mL×1支,，-20℃保存； 試劑四：液體50mL×1瓶,，4℃保存,； 試劑五：粉劑×1支，4℃保存,； 試劑六：粉劑×1支,，4℃保存； 試劑七：粉劑×1支,，4℃保存,； 試劑八：粉劑×1支，4℃保存; 工作液的配制：臨用前把試劑五,、試劑六,、試劑七和試劑八轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用。 PDH的提取
1,、 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。
2,、 4 ℃ 600 g離心5min。
3,、 將上清液移至另一離心管中,，4 ℃ 11000 g離心10min,。
4、 上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的PDH（此步可選做）,。
5、 在沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（功率20％,，超聲3秒，間隔10秒,，重復(fù)30次）,，用于PDH活性測定。
丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒測定步驟
1,、 調(diào)零
用蒸餾水于605nm處調(diào)零,。
2、 樣本測定
（1）取900μL工作液加入1mL玻璃比色皿,，在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）中孵育5min,。 （2）取出比色皿，加入50μL酶液,，混勻,；立即記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）中準(zhǔn)確反應(yīng)1min,，記錄605nm處1min后的吸光值A(chǔ)2,，計算ΔA=A1-A2。 注意事項 1,、測定過程中所有試劑和樣本在冰上放置,，以免變性和失活。 2,、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃,，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中,。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中,。
3、兩個人同時做此實驗,，一個人比色,，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

PDH活性計算 1,、組織中PDH活性計算: （1） 按樣本蛋白濃度計算 單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH活性（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL) （2） 按樣本鮮重計算 單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。 PDH（U/g 鮮重）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL)=905×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL) 2,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞中PDH活性計算： （1）按樣本蛋白濃度計算 單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH活性（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL) （2） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算 單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。 PDH活性（U/104 cell）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷細(xì)菌或細(xì)胞密度(104 cell /mL)=905×ΔA÷細(xì)菌或細(xì)胞密度(104 cell /mL)

丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒