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丙酮酸激酶（Pyruvatekinase,，PK）試劑盒說(shuō)明書(shū)
一,、 測(cè)定意義
丙酮酸激酶酶催化糖酵解過(guò)程中的zui后一步反應(yīng),，是糖酵解過(guò)程中的主要限速酶之一，
也是動(dòng)植物組織中產(chǎn)生ATP 的關(guān)鍵酶之一,，因此測(cè)定動(dòng)植物組織中PK 的活性具有重要意義,。
二、 測(cè)定原理
在二磷酸腺昔（ADP）存在的條件下丙酮酸激酶能夠催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化
成丙酮酸,，丙酮酸與2, 4 -二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,，后者在堿性溶液中顯棕
紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比,，由此計(jì)算丙酮酸激酶活力,。三、試驗(yàn)中所需的儀
器和設(shè)備
可見(jiàn)分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀,、37℃恒溫水浴鍋,、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、1mL玻璃比
色皿或酶標(biāo)板,、蒸餾水
四,、試劑的組成和配制
試劑一：粉劑×1 瓶，常溫保存,，用時(shí)加入50mL 雙蒸水溶解,，4℃保存3 個(gè)月；試劑二：液
體13 mL×1 瓶,，4℃保存3 個(gè)月,；
試劑三：粉劑×1 支，常溫保存,；用時(shí)加1mL 雙蒸水充分溶解;試劑四：
粉劑×1 支,，-20℃保存；用時(shí)加1.2 mL雙蒸水充分溶解,；試劑五：粉劑
×1 支,，-20℃保存；用時(shí)加550μL 雙蒸水充分溶解,；試劑六：2 mmol/L
標(biāo)準(zhǔn)液母液1mL,，-20℃保存1 個(gè)月；試劑七：儲(chǔ)備液15 mL,，4℃避光保
存3 個(gè)月,；
試劑八：終止試劑50 mL,，4℃保存3 個(gè)月,；
五、粗酶液的提取
準(zhǔn)確稱取組織重量,，按重量體積比（g/mL）加9 倍試劑一,，制成10%勻漿。8000g/min
離心10 min,，取上清液待測(cè),，同時(shí)測(cè)定組織蛋白含量。
六,、測(cè)定步驟
取試劑二11.4mL,，試劑三0.69mL，試劑四1.2mL 加入混合液試劑瓶中,，該試劑
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瓶中含有1.71mL液體,，配成總體積為15mL的混合液（該混合液配好后4℃保存1個(gè)月），按下表進(jìn)行操作,。
空白孔B
標(biāo)準(zhǔn)孔S
測(cè)定孔U
對(duì)照孔C
待測(cè)樣本(μL)
10
10
混合液 (μL)
275
275
275
275
試劑五 (μL)
10
蒸餾水 (μL)
20
10
10
試劑六 (μL)
10
充分混勻,，37℃水浴15 分鐘
試劑七(μL)
250
250
250
250
充分混勻，37℃水浴15 分鐘
試劑八(μL)
750
750
750
750
充分混勻,，靜置3 分鐘,，450 nm下測(cè)定吸光度
注意：
1. 以上反應(yīng)體系用1 mL玻璃比色皿測(cè)定,，若需要用酶標(biāo)儀測(cè)定，將反應(yīng)體系中各試劑組 成縮小5 倍即可,。 2. 粗酶液的提取必須在0℃-4℃中操做完成,，以防止酶變性失活。 3. 測(cè)定過(guò)程中所有試劑必須在冰上放置,。
七,、動(dòng)植物組織中PK活力單位的計(jì)算：
丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：
將2mmol/L的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水分別稀釋成1 mmol/L、0.8mmol/L,、0.6mmol/L,、0.4mmol/L、0.2mmol/L溶液,，按照測(cè)定操作表中標(biāo)準(zhǔn)孔體系測(cè)定不同濃度的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值,。
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計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=0.4667χ-0.0013（χ為丙酮酸濃度，mmol/L,； y為吸光值）推出：χ=（y+ 0.0013）÷0.4667（χ為丙酮酸濃度,，mmol/L；y為吸光值） 單位定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)活力單位,。
組織中PK活力= （U/mgprot）
（ODU- ODC）-0.00130.4667×15×Cprot
×1000
ODU： 測(cè)定孔吸光值,； ODC： 對(duì)照孔吸光值： Cprot： 待測(cè)樣本蛋白濃度(mg/mL)； 15 分鐘： 反應(yīng)時(shí)間,；

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