在細(xì)胞中,，蛋白質(zhì)并不是孤單的個(gè)體。大多數(shù)蛋白通過(guò)與分子伴侶或其他蛋白形成復(fù)合物而發(fā)揮其功能,。因此,，在了解細(xì)胞的生物學(xué)特性時(shí)，蛋白質(zhì)相互作用（PPI）研究就成了重要一環(huán),。在藥物開(kāi)發(fā)的過(guò)程中,，這一信息也至關(guān)重要，有助于確認(rèn)藥物靶點(diǎn),。

一提起蛋白質(zhì)相互作用研究,，你的腦海中可能馬上浮現(xiàn)出：酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù),。的確,，這些都是經(jīng)典方法，可有效檢測(cè)體內(nèi)體外蛋白質(zhì)相互作用,。然而,，它們不能提供動(dòng)態(tài)的蛋白相互作用信息，似乎還缺乏一些說(shuō)服力,?；诖耍舱衲芰哭D(zhuǎn)移這種方法受到人們的青睞,。這種能量轉(zhuǎn)移有著嚴(yán)格的距離限制（< 10 nm）,，特別適合評(píng)估蛋白質(zhì)的相互作用。

它的原理并不復(fù)雜，就是兩個(gè)蛋白分子靠近時(shí),，激發(fā)態(tài)能量從一個(gè)熒光基團(tuán)轉(zhuǎn)移到另一個(gè),。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）都屬于這種方法。它們的主要區(qū)別在于,，F(xiàn)RET涉及到兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移,，其中一個(gè)需要適當(dāng)光源的外部激發(fā)，而B(niǎo)RET在底物被氧化之后發(fā)生,，因此不需要外部激發(fā),。如此看來(lái)，BRET相對(duì)FRET有不少優(yōu)點(diǎn),，比如無(wú)需激發(fā)光,，背景更低，也避免了光漂白和自發(fā)熒光等問(wèn)題,。

BRETzui初是在海洋生物中觀察到的,，如水母和海腎。之后,，人們將其用于動(dòng)物和植物研究,。在BRET技術(shù)中，蛋白A融合螢光素酶（通常是海腎螢光素酶）,，作為能量供體,，蛋白B則融合帶有熒光基團(tuán)的標(biāo)簽蛋白，作為能量受體,。如果蛋白A和B存在相互作用,，加入螢光素酶底物后，螢光素酶發(fā)光可以激發(fā)鄰近的蛋白B的熒光基團(tuán)發(fā)光,。如果沒(méi)有相互作用,，那就沒(méi)有熒光咯。

大幅改良的BRET平臺(tái)

目前,，人們大多使用海腎螢光素酶（Rluc）作為能量供體,，黃色熒光蛋白（YFP）作為能量受體，在這之間實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移,。然而,，Rluc和YFP的光譜接近，產(chǎn)生了明顯的背景,。這種高背景增加了檢測(cè)噪音,，也降低了靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍。

于是,，Promega對(duì)BRET方法進(jìn)行大幅改良,。它使用NanoLuc® 螢光素酶作為能量供體,，而HaloTag® 蛋白標(biāo)記的NanoBRET™ 618熒光基團(tuán)作為能量受體，帶來(lái)了的NanoBRET™ 技術(shù),。

集兩大于一身的NanoBRET™,，可不是鬧著玩的。NanoLuc® 螢光素酶的分子量?jī)H為19 kDa（171個(gè)氨基酸）,，更適合于構(gòu)建融合蛋白,。別看它小，它的光信號(hào)比海腎螢光素酶高兩個(gè)數(shù)量級(jí),，因此極少量也能準(zhǔn)確定量,，特別適合細(xì)胞水平蛋白相互作用的研究。

至于能量受體,，Promega利用HaloTag® 蛋白標(biāo)簽技術(shù)來(lái)構(gòu)建,。在評(píng)估了一系列熒光基團(tuán)之后，他們選擇了NanoBRET™ 618配基,。它與NanoLuc® 的波長(zhǎng)配對(duì)更加,，使得檢測(cè)數(shù)據(jù)更加出眾。于是,，來(lái)自NanoLuc® 供體的明亮的藍(lán)移發(fā)光信號(hào)耦合到遠(yuǎn)紅移的HaloTag® 受體上后,，光譜疊加更佳、信號(hào)更強(qiáng),、且與傳統(tǒng)的BRET分析相比背景更低,。

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