實(shí)驗(yàn)原理：PCR擴(kuò)增是模擬天然DNA復(fù)制過程,，利用DNA聚合酶在體外（試管中）擴(kuò)增一對(duì)引物之間特異性DNA片段的方法,。其主要熱循環(huán)過程可分為三個(gè)步驟：
　　 （1）高溫變性（denature）：提供DNA復(fù)制的有效模板。
　　 （2）低溫退火（anneal）：引物與模板DNA復(fù)性，提供游離3’-OH端供DNA復(fù)制起始,；
　　 （3）中溫延伸（extend）：依賴Mg2+,，DNA聚合酶催化合成與模板互補(bǔ)的新的DNA分子。
　　以上變性,、退火,、延伸三個(gè)過程組成一個(gè)循環(huán)周期；常循環(huán)25～40周期,，經(jīng)過n輪循環(huán)后,，靶DNA的拷貝數(shù)理論上呈2n增長；循環(huán)進(jìn)行完畢,，通常zui后還在DNA聚合酶zui適溫度下延伸5～10分鐘,。
操作步驟：本次實(shí)驗(yàn)程序如下：
　　（1）標(biāo)記一個(gè)潔凈的200uL反應(yīng)管,，向其中依次加入：
　　　　ddH2O 36 uL
　　　　10×PCR反應(yīng)緩沖液 5uL
　　　　2mmol/L dNTPs 5uL
　　　　上游引物 1uL
　　　　下游引物 1uL
　　　　DNA模板 1uL
　　　　Taq DNA聚合酶 1 uL
　　　　總體積：50uL
　　 混合均勻后,，蓋緊管蓋，離心5S,，使反應(yīng)成份均勻富集于管底,。
　　（2） 加石蠟油50～100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)（此步驟根據(jù)PCR儀而定,，如帶高溫?zé)嵘wPCR儀不需加入）,。
　　（3） 在PCR儀上設(shè)置反應(yīng)循環(huán)參數(shù),，本次實(shí)驗(yàn)為：94℃ 30s,，56℃ 30s，72℃ 30s,，循環(huán)數(shù)為30,，zui后于72℃充分延伸10 min后終止反應(yīng)（16℃ 3 min）。
　?。?） 置反應(yīng)管于PCR儀上進(jìn)行熱循環(huán),。
　　（5） 反應(yīng)完畢后,，常取5～10％反應(yīng)產(chǎn)物（如本次5uL）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，通過溴乙錠染色，在紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量,，正常DNA電泳帶應(yīng)清晰,、整齊，并通過與已知分子量大小的DNA標(biāo)志物比較,，初步了解產(chǎn)物大小是否與預(yù)期吻合,。

注意事項(xiàng)：
　　 1. 戴手套操作，避免污染
　　　2．冰上操作

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