信帆生物分享：WB實(shí)驗(yàn)常見的問題指南

1. 參考書推薦

A. 對(duì)初學(xué)者看什么資料比較好?解答：《抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》和Antibodies(a laboratory manual,， wrote by Ed Harlow ，david lane)兩本書不錯(cuò),。

2. 針對(duì)樣品的常見問題

B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot (以下簡(jiǎn)寫成Western Blot),，提取線粒體后凍存(未加蛋白酶抑制劑)，用的博士德的一抗,，開始還有點(diǎn)痕跡,，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg,，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行,。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?

解答：懷疑是樣品問題，可能是：1,，樣品不能反復(fù)凍融;2,，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí),，建議檢查Western Blot過程,， 提高一抗?jié)舛取?duì)于加蛋白酶抑制劑來說,，一般加PMSF就可以了,，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

C. 同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎?

解答：當(dāng)然可以,，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品,。

D. 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么?

解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白,，所用的去垢劑就要溫和得多,，這時(shí)加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

E 我的樣品的蛋白含量很低,，每微升不到1微克,，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在,，只是顏色變淡了,，有什么辦法可以解決?

解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間,，多加5-10%甲醇,。

F. 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適?積層膠的濃度又該用多少?這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎?

解答：260kd的蛋白不好做,， 分離膠用6%,， Stacking Gel 3.5%。

G. 如果上樣量超載,，要用什么方法來增加上樣量?如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚,。

解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白,。一般地,，超載30%是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了,，而且小分子量的也要,，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb,。

H. 蛋白變性后可以存放多久?

解答：-80℃,，一兩年沒有問題。zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉;不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了),。

I. 我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD,，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方,，不知為何?

解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用,，因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置,。

J. 接下來我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù),，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系,，不知采用這樣的方案后,，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5%的脫脂奶粉呢?好像有資料說脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成,，是嗎?

解答：不能使用脫脂奶粉,，因?yàn)槊撝谭壑泻锼兀肂SA代替應(yīng)該好一點(diǎn).

K. 還有一問題,，一般一次上樣的蛋白總量是多少,，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎?

解答：Western Blot一般上樣30-100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度,、上樣量,、一二抗的量和撫育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān),。開始摸條件時(shí),，為了拿到陽性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn),，當(dāng)然背景也就出來了,。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易,，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了,，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易,。