ELISA實(shí)驗(yàn)：在ELISA實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的抗原抗體反應(yīng)

1. 抗體的結(jié)構(gòu)

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig),。Ig 分五類,，即IgG,、IgA ,、IgM,、IgD 和IgE,。與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig 主要為 IgG 和IgM,。Ig 由兩個(gè)輕鏈(L)和兩個(gè)重鏈(H)的單體組成,。Ig 的輕鏈?zhǔn)窍嗤模?kappa;(kappa)和λ(Lambda )兩種型別,。五類Ig 的重鏈結(jié)構(gòu)不同,，這決定了它們的抗原性也不同。IgG 和IgM 的重鏈分別稱為γ(gamma )鏈和μ(mu )鏈。重鏈和輕鏈的 N 端的氨基酸排列順序因各種抗體而異,，稱為可變區(qū),，分別用VH 和VL 表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位,，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配,，發(fā)生特異性結(jié)合，是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),。

IgG 可被木瓜蛋白酶分解為三個(gè)區(qū)段,，其中兩個(gè)相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段(Fab )。每個(gè)Fab 都保存結(jié)合抗原的能力,，但只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn),，是單價(jià)的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀,。另一區(qū)段稱Fc 段,，無抗體活性，但具有IgG *的抗原性,。

IgG 可被胃蛋白酶分解為兩個(gè)片段,，一個(gè)Fab 雙體，稱F(ab’)2,，能和兩個(gè)相同的抗原結(jié)合;另一片段類似Fc,，隨后被分解成小分子多肽，無生物活性,。

IgM 是由五個(gè)單體組成的五聚體,，含 10 個(gè)重鏈和10 個(gè)輕鏈，具有10 個(gè)抗原結(jié)合價(jià),，由于空間位置的影響,，只表現(xiàn)為五個(gè)抗原結(jié)合價(jià)。IgM 分子量約為900000,， IgG 分子量約為150000 ,。

機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生 IgM 抗體,，然后產(chǎn)生IgG 抗體,。經(jīng)過一段時(shí)間，IgM 抗體量逐漸減少而消失,，而IgG 抗體可長(zhǎng)期存在,，在疾病*后可持續(xù)數(shù)年之久。IgM 抗體一般為保護(hù)性抗體具有免疫性,。因此IgM 抗體的測(cè)定,，對(duì)某些傳染病如甲型肝炎有較高的研究診斷價(jià)值,。右圖為為甲型肝炎病科研血清中IgG 抗體和IgM 抗體出現(xiàn)的時(shí)間和水平。

2. 抗原抗體反應(yīng)

2.1 可逆性

Ag·Ab 的解離程度與K 值有關(guān),。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合,，兩者結(jié)合牢固，不易解離,。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性,，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中,，特異性的IgG 抗體僅占總IgG 中的極小部分,。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體,，應(yīng)用于免疫測(cè)定中可得到更好的效果,。

2.2 zui適比例

在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物(沉淀)的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例zui合適的范圍,，稱為等價(jià)帶(zone of equivalence )。在等價(jià)帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶,。

如果抗原或抗體極度過剩,，則無沉淀物形成，在免疫測(cè)定中稱為帶現(xiàn)象(zone phenomenon ),?？贵w過量稱為前帶(prezone)，抗原地過量稱為后帶(postzone),。在用免疫學(xué)方法測(cè)定抗原時(shí),，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測(cè)得的量會(huì)小于實(shí)際含量,，甚至出現(xiàn)假陰性,。

2.3 特異性

抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系,，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,。例如乙肝病毒中的表面抗原( HBsAg )、e 抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg),，隨來源于同一病毒,，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng),?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測(cè)定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物(例如血清)中測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物,。

但是這種特異性也不是的,。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如：絨毛膜促性腺激素( hCG)和黃體生成激素(LH)均由α和β兩個(gè)亞單位組成,，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位,，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG 免疫動(dòng)物所得的抗血清中含有抗α-hCG 和抗β-hCG 兩種抗體,，抗α-hCG 抗體將與LH 中的α酶位發(fā)生交叉反應(yīng),。在研究檢驗(yàn)中，如用抗hCG 抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG,，只能用于hCG 濃度較高的試驗(yàn),，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH 將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷(敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG )的實(shí)際中必須應(yīng)用只對(duì)hCG 特異的抗β-hCG,，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生,。

2.4 敏感性

在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為 mg/ml 水平,，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5~10μg/ml,，免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫測(cè)定的敏感度可提高數(shù)千倍,，達(dá)ng/ml 水平,。例如，用放射免疫測(cè)定法或酶免疫測(cè)定法測(cè)定HBsAg,，其敏感度可達(dá)0.1ng /ml,。

3. 免疫測(cè)定在研究檢驗(yàn)中的應(yīng)用

由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原,，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體,，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣,，在研究檢驗(yàn)中可用于測(cè)定：

1) 體液中的各種蛋白質(zhì),，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。

2) 激素,，包括小分子量的甾體激素等,。

3) 抗生素和藥物。

4) 病原體抗原,，HBsAg,、HBeAg 等。

5) 另外,，也可利用純化的抗原檢測(cè)標(biāo)本中的抗體,，例如抗-HBs 等。

4.標(biāo)記的免疫測(cè)定

如上所述,，免疫測(cè)定是一種很敏感的測(cè)定方法,，抗原抗體反應(yīng)后直接測(cè)定形成的沉淀或濁度,，敏感度可達(dá) 5~10μg/ml，但在研究檢驗(yàn)中,，某些待測(cè)物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平,，因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測(cè)定是將檢測(cè)試劑中的抗原或抗體用可微量測(cè)定的物質(zhì)加以標(biāo)記,，通過測(cè)定標(biāo)記物來提高敏感度,。在放射免疫測(cè)定和酶免疫測(cè)定中，標(biāo)記物分別為放射性核素和酶,，zui后用測(cè)定放射性和酶活力來計(jì)算待檢物的量,，敏感度可比直接測(cè)定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測(cè)定中,，一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測(cè)物*反應(yīng),。以標(biāo)記抗體(Ab ※)檢測(cè)抗原(Ag)為例，反應(yīng)式如下：

Ag+ Ab※→ AgAb※+ Ab※

在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag 結(jié)合的Ab※和游離和Ab※ ,，如不將兩者分離而測(cè)定標(biāo)記物,，測(cè)得的結(jié)果將為兩者之和。因此,，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測(cè)定中的重要步驟,。可采用多種手段,，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上,，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng),，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中,。這樣可以通過洗滌將游離的Ab ※除去,，結(jié)合標(biāo)記物的測(cè)定可在固相上進(jìn)行。

5.酶免疫測(cè)定

酶免疫測(cè)定(enzyme immunoassay )可分為均相(homogenous)和非均相(heterogenous )兩種類型,。

在均相EIA 中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測(cè)定標(biāo)記物,。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對(duì)底物作用的活力,，因而測(cè)出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物,。均相EIA 在研究檢驗(yàn)中較少應(yīng)用。非均相EIA 需*行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離,。如前所述,，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971 年zui初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay ),，簡(jiǎn)稱ELISA ,，在國內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的,，雖然含義不*確切，但已習(xí)用,。

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