1.制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDSPAGE凝膠。將10×substrateG融化,，并90ºC加熱5分鐘,。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10×substrateG并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED,，等待凝膠聚合,。
2.待測(cè)樣品1:1稀釋于2×SDS-PAGEnon-reducingbuffer（用完后可自行配制：4%SDS,100mMTris-ClpH6.8,20%glycerol,0.02%bromophnolblue），混合后直接上樣,。切勿加熱變性,，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,，使用普通蛋白預(yù)染Marker即可。陽(yáng)性對(duì)照（可選步驟）：可取人,、小鼠,、大鼠或兔100μl全血與100μl2×SDS-PAGEnonreducingbuffer等體積混合，取5-15μl上樣,。
3.低電流恒流電泳,，每一塊小膠電流為20mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳,。
4.洗滌凝膠：取出凝膠,，去除濃縮膠，放入容器內(nèi),?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10ml1×BufferA（用蒸餾水稀釋）,，室溫漂洗凝膠2×30分鐘,。中間換液。
5.孵育：倒掉BufferA,。加入10ml1×BufferB（蒸餾水稀釋）,，室溫或37ºC孵育1~5小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小時(shí)即可顯示,。如MMP活性低,，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過夜。
6.顯色：倒掉BufferB,，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書）,。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域,。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2,、MMP-9的大小位置（酶譜）及活性,。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72（MMP-2）、92（MMP-9）,、130（proMMP-9）,、225（proMMP-9）kDa
位置出現(xiàn)透明條帶。
7.條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描,。雖然MMP條帶透明,，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描,，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,，并盡量設(shè)置為黑色。MMP條帶則為白色,，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式,。
