1 、獲取細胞或組織裂解物
1）根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer；
2）選擇合適的蛋白酶抑制劑,，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性,。
2 ,、蛋白定量
3 ,、電泳分離蛋白質
4 、轉膜：根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型,。
5 ,、封閉：去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景,。
6 ,、一抗孵育
一抗的選擇成功與否,，是整個
WB實驗代測成功的關鍵，選擇一抗有以下幾個注意點：
1）選擇適合檢測標本種屬的一抗,；
2）選擇適用于WB實驗方法的一抗,；
3）選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體,。
7 、二抗孵育：孵育條件一般為室溫1-2小時,。
8 、底物孵育：選擇顯色或者化學發(fā)光底物,。一般傾向于化學發(fā)光,，靈敏度高且背景低,，節(jié)省抗體用量。
9 ,、結果分析和檢測：凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片,。
