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雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：

　　1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗體,。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

　　2） 加受檢標本,，保溫反應,。標本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物?！　∠礈斐テ渌唇Y(jié)合物質(zhì),。

　　3） 加酶標抗體，保溫反應,。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合　　的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關,。

　　4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。通過比色,，測知標本中抗原的量?！　≡谘芯繖z驗中,，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg,、HBeAg,、AFP、hCG等,。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物,。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物,。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應,，作一步檢測,。

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　　在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時,，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合,，而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見1.3.2,，圖1-4），如按常法測讀,，所得結(jié)果將低于實際的含量,，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時,，反應甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時,，應注意可測范圍的zui高值,。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

　　假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,，例如HBsAg的a決定簇,，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題,，HBsAg有adr,、adw、ayr,、ayw4個亞型,，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題,。

　　雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾,。RF是一種自身抗體，多為IgM型,，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合,。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份,，同時與固相抗體和酶標抗體結(jié)合,，表現(xiàn)出假陽性反應。采用F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,，由于去除了Fc段,，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）,。

　　雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,，因其不能形成兩位點夾心,。

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