20世紀(jì)中期,，以放射免疫技術(shù)為代表的標(biāo)記免疫技術(shù)相繼問世,，它將某種可微量或超微量測(cè)定的物質(zhì)（如放射性核素,、熒光素,、酶,、化學(xué)發(fā)光劑等）標(biāo)記于抗原（抗體）上制成標(biāo)記物,，加入到抗原抗體的反應(yīng)體系中與相應(yīng)的抗體（抗原）反應(yīng)，以檢測(cè)標(biāo)記物的有無及含量間接反映被測(cè)物的存在與多少,。這些將標(biāo)記技術(shù)與抗原抗體反應(yīng)結(jié)合起來的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)以其敏感性高,、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)便,、易于商品化和自動(dòng)化等特點(diǎn)逐漸替代了凝集,、沉淀等經(jīng)典的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，不僅用于抗原,、抗體,、補(bǔ)體、免疫細(xì)胞,、細(xì)胞因子等免疫相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè),，也用于酶、微量元素,、激素,、微量蛋白等體液中各種微量物質(zhì)的檢查，可以說一切具有抗原性或半抗原性的物質(zhì)原則上均可利用現(xiàn)代免疫檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),，使免疫學(xué)檢驗(yàn)滲透到醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

　　目前,，免疫學(xué)檢驗(yàn)中的標(biāo)記技術(shù)主要包括酶免疫技術(shù),、熒光免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù),、金免疫技術(shù),、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)等。其中酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑,，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的性和專一性結(jié)合起來的一種免疫檢測(cè)技術(shù),。作為經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)之一，酶免疫技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用并不斷得到更新。

一,、常用的酶及顯色底物

　　在酶免疫技術(shù)中用于標(biāo)記的酶應(yīng)具有催化活性高,、催化專一性強(qiáng)；與抗原抗體偶聯(lián)后不影響抗原抗體的免疫反應(yīng)性和酶活性,；催化的底物易于配制,、保存且催化底物產(chǎn)生的信號(hào)產(chǎn)物易于觀察和檢測(cè)；對(duì)人無害且價(jià)廉,、易得等特點(diǎn),，目前常用的酶及底物見表1。

表1 常用酶及底物

二,、標(biāo)記物的制備

　　在酶免疫技術(shù)中制備標(biāo)記物的抗原應(yīng)純度高,、抗原性完整；制備標(biāo)記物的抗體應(yīng)特異性好,、效價(jià)高,、親和力強(qiáng)、比活性高,、能批量生物試劑和易于分離純化,。

　　制備酶標(biāo)記物的方法應(yīng)符合簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高,；避免酶,、抗體（抗原）、酶標(biāo)記物各自形成聚合物,；標(biāo)記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則,。標(biāo)記物制備的方法基本屬于兩類：

（一） 交聯(lián)法

　　交聯(lián)法是以一可同時(shí)與酶和抗體（抗原）結(jié)合的 交聯(lián)劑作為“橋”，分別連接酶與抗體（抗原）的方法,，此類方法中目前zui常用的是戊二醛交聯(lián)法,，形成的結(jié)合物為：酶-戊二醛-抗體（抗原）

（二） 直接法

　　直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團(tuán)直接可與抗體（抗原）結(jié)合形成標(biāo)記物,，如過碘酸鈉法,。形成的結(jié)合物為：酶-抗體（抗原）。

三,、酶免疫技術(shù)類型

　　酶免疫技術(shù)按照抗原抗體系統(tǒng)是定位于組織細(xì)胞上還是存在于液體樣品中分為酶免疫組化技術(shù)和酶免疫測(cè)定（EIA）,，酶免疫測(cè)定又可分為均相酶免疫測(cè)定和異相酶免疫測(cè)定。

（一） 均相酶免疫測(cè)定

　　均相酶免疫測(cè)定是利用酶標(biāo)記物結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物后,，標(biāo)記酶的活性就受到抑制,，因而反應(yīng)后不需分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物，直接測(cè)定系統(tǒng)中的總標(biāo)記酶的活性的變化,，即可確定結(jié)合的酶標(biāo)記物的數(shù)量,，從而得到待測(cè)物的含量的一種技術(shù)。常用于半抗原或小分子抗原如藥物、激素等的測(cè)定,。常用的技術(shù)類型有：

1．酶免疫增強(qiáng)測(cè)定技術(shù)（EMIT）：酶免疫測(cè)定增強(qiáng)技術(shù)中酶活性的抑制是由于標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合后空間位阻了酶與底物結(jié)合的部位而造成的,。反應(yīng)模式常用競(jìng)爭(zhēng)法，即當(dāng)未標(biāo)記抗原多,，競(jìng)爭(zhēng)性的與抗體結(jié)合多,，則標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合少，酶的活性受到抑制少,，酶活性高,。因此，zui終測(cè)得的酶活性與未標(biāo)記物的含量呈正相關(guān),。
 

2．克隆酶供體免疫分析（CEDIA）：克隆酶供體免疫分析中酶是以供體和受體兩個(gè)片段存在的,，只有兩個(gè)片段結(jié)合在一起形成全酶才能具有活性，當(dāng)標(biāo)記了供體酶的抗原與抗體結(jié)合后就空間位阻了酶供體（ED）與酶受體（EA）的結(jié)合,，從而不能形成有活性的全酶,，酶活性受到抑制。在反應(yīng)模式上同樣為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析方法,，zui終測(cè)得的酶活性與未標(biāo)記抗原的含量呈正相關(guān),。
 

（一） 異相酶免疫測(cè)定

　　異相酶免疫測(cè)定與均相酶免疫測(cè)定的zui大區(qū)別是抗原抗體反應(yīng)平衡后，在反應(yīng)體系中同時(shí)存在著游離的和結(jié)合的兩種酶標(biāo)記物,，兩種標(biāo)記物上的酶都具有酶活性,，而只有結(jié)合的酶標(biāo)記物的形成與含量才代表待測(cè)物的存在與含量。因此,，需將游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物分離,，測(cè)定結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)物的活性推算待測(cè)物的含量。因分離游離和結(jié)合的標(biāo)記物的方法不同,，異相酶免疫測(cè)定又分成液相酶免疫測(cè)定和固相酶免疫測(cè)定兩類方法,。液相酶免疫測(cè)定，由于游離的和結(jié)合的標(biāo)記物都存在于液相中,，故需用分離劑將二者分開后才能測(cè)定結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物的活性,。而固相酶免疫測(cè)定，是通過載體將結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物吸附在固相支持物上,，只需洗滌就可將游離的酶標(biāo)記物去除,。目前固相酶免疫測(cè)定以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）為zui常用。

　　綜上所述酶免疫技術(shù)的類型可歸納為：

一,、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

（一） 基本原理

　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的基本原理是將過量抗體（抗原）包被于載體上，通過抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上,，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)記抗體（抗原）后,，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物確定待測(cè)物的存在與含量的檢測(cè)技術(shù)。

（二） 技術(shù)類型

　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法,、間接法,、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法等,。

1．各種技術(shù)類型的原理如下：雙抗體夾心法用于檢測(cè)抗原,。它是利用待測(cè)抗原上的兩個(gè)抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)記抗體B結(jié)合，形成抗體A-待測(cè)抗原-酶標(biāo)抗體B復(fù)合物,，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原含量成正比,，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。

　　間接法用于測(cè)定抗體,。它的原理是將已知抗原連接在固相載體上,，待測(cè)抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測(cè)抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物,，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體量成正比,，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。

　　競(jìng)爭(zhēng)法既可用于檢測(cè)抗原又可用于檢測(cè)抗體,。它是用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測(cè)的非標(biāo)記抗原（抗體）競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的*抗體（抗原）結(jié)合,，待測(cè)抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多,，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少,，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此,，顯色程度與待測(cè)物含量成反比,。

　　捕獲法用于測(cè)定IgM類抗體。固相載體上連接的是IgM的二抗,，先將標(biāo)本中的IgM類抗體捕獲,，防止IgG類抗體對(duì)IgM測(cè)定的干擾，此步驟也是其稱為捕獲法的原因所在,，然后再加入特異抗原和酶標(biāo)抗體,，形成抗體IgM-IgM-特異抗原-酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，復(fù)合物含量與待測(cè)IgM成正比,，也屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型,。

2.各種技術(shù)類型的主要區(qū)別：見表2 。

表2 ELISA常用技術(shù)類型比較

（三） 技術(shù)要求

1.常用的固相載體：ELISA中zui常用的固相載體用聚苯乙烯制備,，可制成微量反應(yīng)板,、小試管和小株，現(xiàn)多用微量反應(yīng)板,，它吸附性能好,、空白值低,、孔底透明度高、批間穩(wěn)定性好,、價(jià)格低廉且易于與自動(dòng)化儀器配套,。另外，聚乙烯,、聚氯乙烯酰胺等塑料制品也有使用,。除塑料外，還可使用膜載體（如硝酸纖維素膜）,、磁化微顆粒等,。

2．固相包被物的制備：固相包被物的制備方法可以是吸附或化學(xué)偶聯(lián)。用聚苯乙烯做載體包被抗原（抗體）常用吸附的方法,。4℃放置一夜或37℃2～6h經(jīng)清洗后即可應(yīng)用,。為防止包被后載體上留有未包被的空隙而導(dǎo)致本底過高，常用1％～5％牛血清白蛋白封閉空隙,。

3．*工作濃度的選擇：在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中為防止本底高和靈敏度低,，需要對(duì)包被抗體（抗原）和酶標(biāo)抗體（抗原或二抗）進(jìn)行滴定和選擇*工作濃度。如夾心法*工作濃度的選擇是用棋盤滴定法同時(shí)選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度,。如表三所示包被抗體選擇3個(gè)濃度酶標(biāo)抗體也選擇3個(gè)濃度分別與包被抗體的3個(gè)濃度配伍,，然后分別加入強(qiáng)陽性抗原、弱陽性抗原和陰性對(duì)照,，得到27個(gè)A值,，以強(qiáng)陽性抗原A值在0.8，陰性對(duì)照A值<0.1為*工作條件,，按照表3的測(cè)定結(jié)果可知包被抗體的*工作濃度是1mg/L,，酶標(biāo)抗體的工作濃度是1：5,000。

表3 雙抗體夾心法包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度選擇的棋盤法

二,、酶免疫技術(shù)的發(fā)展

　　酶免疫測(cè)定具有高度敏感性,、特異性，而且它的試劑比較穩(wěn)定,，操作簡(jiǎn)單且無放射性危害,，特別是商品試劑盒和自動(dòng)化儀器的應(yīng)用，使其成為一種適用于各級(jí)檢驗(yàn)部門的免疫標(biāo)記技術(shù),。隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,，酶免疫測(cè)定的方法、技術(shù)也得到發(fā)展和更新,，斑點(diǎn)-ELISA,、發(fā)光酶免疫測(cè)定、免疫印跡法,、BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法不斷得到應(yīng)用,。

（一）斑點(diǎn)-ELISA

　　斑點(diǎn)-ELISA的原理與ELISA的區(qū)別在于用對(duì)蛋白質(zhì)有*吸附力的硝酸纖維素膜代替塑料制品作為固相載體,，酶作用底物后在硝酸纖維素膜上形成有色沉淀而使膜著色。它的靈敏度較一般ELISA高6～8倍,、可達(dá)ng水平，試劑用量小,，不需其它設(shè)備條件,。

（二）免疫印跡法

　　免疫印跡法是將電泳與ELISA結(jié)合起來的一種方法。它先經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚苯烯酰胺凝膠電泳將樣品進(jìn)行分離,，通過轉(zhuǎn)印將被分離的各區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,，然后把印有蛋白質(zhì)條帶的膜當(dāng)成包被抗原的固相載體，做酶免疫測(cè)定,。所以它的方法分為電泳,、轉(zhuǎn)印、酶免疫測(cè)定三個(gè)階段,。免疫印跡法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測(cè)定的高敏感性和特異性,，是一種能用于分析樣品組分的免疫學(xué)測(cè)定方法。

（三）發(fā)光酶免疫測(cè)定

　　發(fā)光酶免疫測(cè)定與一般EIA的區(qū)別是酶所催化的底物是發(fā)光劑,。產(chǎn)物不是一般EIA的有色物質(zhì),，而是發(fā)光產(chǎn)物，所發(fā)出的光可用特定的儀器測(cè)定,。常用的酶是HRP和AP,，HRP的發(fā)光底物有魯米諾及衍生物、對(duì)-羥基苯乙酸,；AP的底物為3-（2--螺旋金剛烷）-4-甲氧基-（3-磷酸氧基）-苯基-1,，2-二氧乙烷和4-甲基傘形酮磷酸鹽。

（四）BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

　　BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是將生物素-親和素（BAS）放大系統(tǒng)與ELISA結(jié)合起來的一種技術(shù),。生物素（B）是一種小分子的生長(zhǎng)因子,，有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)可以和親和素結(jié)合,，另一個(gè)可以和包括酶,、抗原（抗體）的多種物質(zhì)結(jié)合。親和素（A）又稱卵白素,，有4個(gè)亞基,，都可與生物素穩(wěn)定結(jié)合，此為放大系統(tǒng)的關(guān)鍵,，即有1個(gè)親和素就能結(jié)合4個(gè)生物素,，親和素也可被酶標(biāo)記。

　　在BAS的應(yīng)用中正是利用了生物素和親和素的這些特點(diǎn),，設(shè)計(jì)了兩類反應(yīng)類型：一類是以游離親和素為“橋”,，分別連接生物素化抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)和酶標(biāo)生物素,。此種類型有BAB法和ABC法，另一類是直接用標(biāo)記親和素連接生物素化抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng),，此種類型有BA法,。以雙抗體夾心法測(cè)抗原為例，各種類型的反應(yīng)式表示如下,。

BAB法的反應(yīng)式可表示為：固相抗體＋待測(cè)抗原＋抗體-生物素＋親和素＋生物素-酶＋底物,。

ABC法的反應(yīng)式可表示為：固相抗體＋待測(cè)抗原＋抗體-生物素＋親和素＋生物素-酶-底物。

BA法的反應(yīng)式可表示為：固相抗體＋待測(cè)抗原＋抗體-生物素＋親和素-酶＋底物,。

這種通過BAS放大作用可將更多的酶聚集在固相載體上,，使酶免疫技術(shù)檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提高。