ELISA試驗(yàn)中,對于細(xì)胞樣本的處理方法總結(jié)如下:

對于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：

1. 融解RIPA裂解液，混勻,。取適當(dāng)量的裂解液,，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM,。

2. 對于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液,，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾,，可以不洗）,。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下,，使裂解液和細(xì)胞充分接觸,。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會被裂解。

對于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞,，用手指把細(xì)胞用力彈散,。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞,。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀,。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管,，然后再裂解,。

3. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘,，取上清,，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作,。

裂解液用量說明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠,，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升,。

對于組織樣品：

1. 把組織剪切成細(xì)小的碎片,。

2. 融解RIPA裂解液，混勻,。取適當(dāng)量的裂解液,，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM,。

3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液,。（如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品,，可以適當(dāng)減少裂解液的用量,。）

4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解,。

5. 充分裂解后,，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清,，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE,、Western和免疫沉淀等操作。

6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小,，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解,，通過強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分,。

注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物,，屬正常現(xiàn)象,。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物,。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,，例如NF-kappaB、p53等時,，通常不必進(jìn)行超聲處理,，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

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