ChIP實驗研究轉(zhuǎn)錄因子,，調(diào)控因子結(jié)合的DNA和組蛋白結(jié)合的NDA操作上最大的區(qū)別是什么？

ChIP實驗中由于組蛋白在染色質(zhì)中表達(dá)相對較高,，表達(dá)也較穩(wěn)定,，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)水平很低，往往是瞬時表達(dá),。所以組蛋白研究起來更為容易,，一般需要105-106個細(xì)胞即可完成一個ChIP反應(yīng)。研究起始樣本量（細(xì)胞,，組織）要是組蛋白的10倍,，一般每個反應(yīng)至少需要107個細(xì)胞。另外有些轉(zhuǎn)錄因子比較大,，往往結(jié)合多個核小體,，因此在染色質(zhì)斷裂的時候，不太適合使用酶法的處理方式,，建議使用超聲斷裂染色質(zhì)的方法,。因為酶法是化學(xué)處理，消化的位點往往比較均一,，多是在核小體的連接處,，酶消化有可能將核小體斷裂的同時打斷轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合,。

ChIP實驗中使用超聲方法斷裂染色質(zhì)溫度不易控制，可能會使蛋白變性,，影響ChIP結(jié)果,，有沒有較好的優(yōu)化方案？

ChIP實驗中超聲的優(yōu)化一般從如下幾個方面考慮：

1 不建議重復(fù)已發(fā)表的剪切方案而不進(jìn)行優(yōu)化,。當(dāng)儀器不同于文獻(xiàn)中所使用的儀器時,，尤其如此。

2 目前有各種超聲破碎儀器,，水浴和基于探頭的,。在使用基于探頭的超聲破碎儀時，選擇一個適用于您的樣品體積的探頭,。

3 在任何情況下,，剪切參數(shù)都應(yīng)當(dāng)根據(jù)您的樣品體積、細(xì)胞密度和細(xì)胞類型而優(yōu)化,。

4 優(yōu)化應(yīng)當(dāng)包括功率設(shè)置（超聲時間 vs. 間隙時間/休息時間）以及獲得長度為200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循環(huán)數(shù),，每個優(yōu)化實驗只優(yōu)化一種參數(shù)；

5 注意時間和功率設(shè)置,。過度破碎和太高功率設(shè)置會損害在免疫沉淀步驟中的表位,。降低ChIP信號。

6 始終保持裂解液冰冷,，間斷超聲,，而不是連續(xù)，因為超聲處理產(chǎn)生熱量會使染色質(zhì)變性,。

7 在超聲破碎過程中避免氣泡,。泡沫會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面變性，可能使染色質(zhì)損失在氣泡中,。為了避免這種情況,，一開始設(shè)為較低功率，再逐步提高,。

8 在優(yōu)化條件時,，每個超聲破碎循環(huán)后通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段的長度。剪切不足所產(chǎn)生大的不溶蛋白質(zhì):DNA:RNA復(fù)合物可能堵塞瓊脂糖凝膠的孔,，并延緩電泳過程,。通過消化蛋白質(zhì)、逆轉(zhuǎn)交聯(lián),、酚:氯仿提取和沉淀來純化DNA,。

染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）實驗檢測