專業(yè)的RT-PCR實驗代測服務(wù)商

服務(wù)內(nèi)容：

1.制定個性化實驗方案：根據(jù)不同的實驗?zāi)康拇_定實驗方案,、選定合適的內(nèi)參；
2.檢測類別：mRNA,、miRNA,、lncRNA、DNA,；
3.樣本抽提及質(zhì)檢：對客戶提供樣本進行RNA抽提,，并利用NanoDrop進行樣本質(zhì)檢；
4.定量PCR預(yù)實驗：包括樣本反轉(zhuǎn)錄為CDNA,、配置PCR反應(yīng)體系及進行Real-TimePCR反應(yīng),；
5.正式定量PCR實驗：根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進行正式實驗；
6.數(shù)據(jù)分析：采用2- △△CT法進行分析,，比較不同樣本間差異,。

服務(wù)要求：
1.請?zhí)峁┙M織樣本，細胞樣本,，血漿或血清樣本,，totalRNA；
2.請?zhí)峁┮阎娜L基因序列或GeneBank號,；
3.請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA來源,、基因豐度等。

結(jié)果內(nèi)容：整理好的報告,，樣本收到之日起5個工作日內(nèi)反饋質(zhì)檢結(jié)果,。

結(jié)果展示：

樣本質(zhì)檢圖

溶解曲線：

擴增曲線

數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個指標有2張圖。一張是擴增曲線，另一張是熔解曲線,，用來證明PCR擴增中無非特異性擴增

送樣運輸要求：

1. 樣品處理

a. 動物組織：常規(guī)組織,，脂肪組織，結(jié)締組織,，纖維化組織適當增加,。將組織剪切成合適大小后（建議組織塊長寬高均不大于0.5 cm），然后迅速浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中,。（注意：已浸入RNAsolidTM試劑中的組織經(jīng)平衡一段時間后,，可從溶液中取出，切成更小的組織塊,，再重新放回RNAsolidTM試劑中,；有些比較弱的液體滲透性組織如骨頭等，不適合用RNAsolidTM試劑進行RNA保護,。）

b.植物組織：新鮮的葉,、果肉、種子最少100 mg,。將嫩葉,，嫩莖組織切成合適的大小（建議長寬高均不大于0.5 cm）后,，然后迅速浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中,。（注意：某些植物組織天生具有的屏障，如葉子表面的蠟層可阻礙RNAsolidTM試劑的滲透,，對于此類組織,，通常需破壞這些屏障層以允許溶液的浸透。）

c.細胞等樣本：收集不小于10^6個細胞的沉淀（用PBS清洗1-2次）,。之后迅速加入5～10倍體積的RNAsolidTM試劑,。

d.酵母、細菌等樣本：離心棄上清,，收集小米粒大小的單菌體沉淀,，然后迅速加入適量的RNAsolidTM試劑浸沒菌體沉淀。

e. RNA樣品： OD260/280為1.8-2.0,，濃度≥100 ng/μL,，體積≥20μL，干冰運輸,。

f.cDNA：cDNA原液≥20 μL,，干冰運輸。

2. 樣品保存及運輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1～2天,，2天以后部分組織中的RNA會開始降解,。室溫（25℃）穩(wěn)定保存1周,，不會有明顯的RNA降解發(fā)生。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中,，4℃條件下可穩(wěn)定保存1個月,，不會有明顯的RNA降解發(fā)生。長期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過夜,，然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去,，再將樣本放入-20℃或-80℃長期穩(wěn)定保存3～5年。

關(guān)于Real-time qPCR如何進行數(shù)據(jù)分析

1. Real-time qPCR常見參數(shù)

基線（baseline）

通常是3-15個循環(huán)的熒光信號

同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線

閾值（threshold）

自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍

手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期,，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強

同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值,，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系,。

分析定量時候一般取Ct:15-35,。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值,。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）,。

2. 影響Ct值的關(guān)鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素?？刂圃谝粋€合適范圍內(nèi),，使Ct在15-35之間

反應(yīng)液成分的影響

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度,。

PCR反應(yīng)的效率

PCR反應(yīng)的效率也會影響Ct值,。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比,，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標準曲線,。PCR效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量,。一般說來,，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評估實時定量PCR反應(yīng)的效果

PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率,，至少需要做3次平行重復(fù),，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。

另一個評估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2,，它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語,。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準確預(yù)測X值（量）,。如果R2等于0,，你就不能通過Y值來預(yù)測X值。R2值大于0.99 時,，兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好,。

標準偏差（standard deviation,，偏差的平方根）是的精確度計量方法。

如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值,，那么標準偏差就?。蝗绻S多數(shù)據(jù)點都遠離平均值,，則標準偏差就大,。實際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會形成大致的正態(tài)分布,。這經(jīng)?？赏ㄟ^經(jīng)典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態(tài)分布,。如果PCR反應(yīng)效率是 100%,，那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應(yīng)該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度,，標準偏差就必須小于等于0.167,。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低,。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋,，標準偏差必須小于等于 0.250

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