組織細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒的使用方法

本試劑盒能夠從哺乳動(dòng)物新鮮或凍存的組織塊,、貼壁或懸浮細(xì)胞中制備細(xì)胞 膜與胞內(nèi)質(zhì)膜組分,。其試劑成分與優(yōu)化的制備方案使胞膜制備過(guò)程簡(jiǎn)單易行，無(wú)需特殊設(shè)備和超速離心,，可在1小時(shí)內(nèi)完成,。應(yīng)用本試劑盒制備的胞膜是細(xì)胞 膜和細(xì)胞器膜如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及質(zhì)膜的混合物,。制備得到的產(chǎn)物純度可勝任后續(xù)的免疫沉淀,、蛋白印跡,、2-D gel、酶活性檢測(cè)和受體分析等實(shí)驗(yàn),。

組成：（以下是50次規(guī)格用量）

CER  (Cytosol Extraction Reagent)       25ml    

MER (Membran Extraction Reagent)     2.5ml

Suspension Buffer                      10ml

儲(chǔ)存：各組分4度 有效期12個(gè)月

操作步驟：

一．樣本預(yù)處理：

收集細(xì)胞：（在每一次制備過(guò)程中,，使用等量的細(xì)胞數(shù)將明顯提高后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的一致性，因此建議在制備前對(duì)細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)）

1.      貼壁細(xì)胞：用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞平皿,，用胰蛋白酶消化細(xì)胞,。800g離心5-10分鐘，棄上清,，用PBS緩沖液重懸洗滌細(xì)胞并再次離心收集細(xì)胞。

2.      懸浮細(xì)胞：800g離心5-10分鐘,，棄上清,。用PBS緩沖液重懸洗滌細(xì)胞并再次離心收集細(xì)胞。

以下制備過(guò)程要在4 oC或冰水浴中進(jìn)行

二．組織細(xì)胞勻漿裂解

1.      細(xì)胞勻漿裂解

向每1x107個(gè)細(xì)胞或每100µl（細(xì)胞離心后的體積）細(xì)胞沉淀中加入500µlCER試劑,，震蕩重懸,，冰浴2分鐘。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi),，在冰水浴中上下手動(dòng)勻漿20-30次,。

注意：此破碎細(xì)胞步驟為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。要使用1-3ml小容積玻璃勻漿器,，須選用間隙嚴(yán)密的研杵,，其特征是將研杵插入勻漿器套管后，可提起研杵而套管不會(huì)脫落,。有效研磨是上下推拉而不是旋轉(zhuǎn),。破碎效果與細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)，可在相差顯微鏡下檢查,，未裂解細(xì)胞應(yīng)小于5%,。

2.        組織塊勻漿裂解：

取250mg哺乳動(dòng)物新鮮或-80 oC凍存組織塊放入冰預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)，加入500µlCER試劑,。用研杵搗碎組織塊,，上下手動(dòng)勻漿20次，冰浴10分鐘,，然后上下手動(dòng)勻漿7次,。

注意：與培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁細(xì)胞相比，組織塊中的細(xì)胞在勻漿時(shí)較易破碎,，因而并非必須選擇間隙嚴(yán)密的研杵,。如果研杵與套管過(guò)于嚴(yán)密，會(huì)使組織勻漿困難,，可選用研杵與套管稍松的勻漿器,，破碎效果與組織細(xì)胞類(lèi)型有關(guān),，可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細(xì)胞應(yīng)少于5%,。

三,、粗提物制備：

取約500µl裂解物，轉(zhuǎn)移到新的離心管中,，800g ,4oC離心5分鐘,。上清為胞膜-胞漿混合物。

四,、胞膜胞漿制備：

1）將步驟三獲得的上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中,，估計(jì)上清的體積； 2）加入上清液1/10體積的MER與上清液混合,，冰浴5分鐘,；3）14,000rpm，4oC離心30分鐘,；4）沉淀為胞膜組分,，含有細(xì)胞 膜和亞細(xì)胞器碎片，可短暫離心除盡液體,，用50-100µl Suspension Buffer重懸備用或用RIPA裂解胞膜,；做WB時(shí)膜蛋白分子量100KD以上的建議用較強(qiáng)的蛋白提取試劑如加強(qiáng)的RIPA，便于獲取溶解度低的膜蛋白,，具體方案根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康拇_定,。             

說(shuō)明：

1.       Suspension Buffer不含去垢劑，重懸于Suspension Buffer中的胞膜或胞核組分呈不溶解狀態(tài)是正常的,，用戶可用自備溶液重懸胞膜或胞核成分,。如果進(jìn)行蛋白印跡、2-D get等實(shí)驗(yàn),，用戶可用SDS上樣緩沖直接裂解細(xì)胞 膜或細(xì)胞核成分,。對(duì)于進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，可用RIPA裂解液（C1053）重懸胞膜,。

2.      試劑盒各組分中未添加蛋白酶抑制劑,，可自行選擇添加。

組織細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒的使用方法