植物超氧陰離子染色液(NBT法)的使用方法

植物組織在脅迫環(huán)境條件下會產(chǎn)生多種活性氧（ROS）,，ROS活性非常大且極其不穩(wěn)定，因此ROS的檢測通常因其最終產(chǎn)物而定,。超氧陰離子是活性氧的一種,，屬于一種含氧自由基，能將NBT（氮藍(lán)四唑）還原成不溶于水的藍(lán)色甲瓚化合物,，從而定位組織中的超氧陰離子,。根據(jù)基本原理也稱其為NBT法。本產(chǎn)品就是基于以上原理,，用于植物活組織中的超氧陰離子染色,。一般應(yīng)用于較嫩的根尖、葉片等的整體染色,，染色后有超氧陰離子聚集的部位呈藍(lán)色至深藍(lán)色,。

使用方法

1. 試劑準(zhǔn)備：將50 mg NBT以Tris緩沖液(pH 7.4) 100 mL充分溶解,，得到NBT染色工作液，避光4℃保存,，一周內(nèi)有效,。

2. 采集植物幼苗或根尖，純水稍洗凈,，濾紙上吸干多余水分,。將植物幼苗或根尖浸入NBT染色工作液中，常溫避光浸染2-6 h,，至陽性部位出現(xiàn)深藍(lán)色,，其余部位為淡藍(lán)色或近無色或呈植物本身的顏色即可（根據(jù)植物幼嫩程度。顯色程度調(diào)整染色時間）,。

3. 用鑷子將植物幼苗或者葉片小心取出,，純水漂洗3-5次，置于濾紙上吸干多余水分后,，浸入95%乙醇中40℃處理3-16 h,，目的是脫去植株幼苗或者葉片本身的葉綠素或者淡藍(lán)色背景，處理期間可多次更換新鮮的95%乙醇,。

4. 用鑷子取出植株幼苗或者葉片,，浸入純水中來回漂洗3-5次，置于濾紙上吸干多余水分后,，將樣本轉(zhuǎn)入適量NBT樣本保存液中浸泡30 min后,，隨后可取出拍照。樣本可置于該溶液中常溫保存一周,。

注意事項(xiàng)

1. NBT染色工作液配制好以后需4℃避光保存,，一周內(nèi)使用。存放時間過久,，會影響顯色,。

2. 因任何外在因素都可能刺激植物應(yīng)激產(chǎn)生超氧陰離子，因此植物樣本需要新鮮采集,，并盡快完成染色,。建議做陰性及陽性空白對照組。

3. 樣本染色完成后盡快拍照保存結(jié)果,。

4. 操作時請穿實(shí)驗(yàn)服,，并佩戴一次性手套。

植物超氧陰離子染色液(NBT法)的使用方法